基于混合氣凝膠負載銀納米粒子構建電化學傳感器用于食品過氧化氫的測定

張翠忠，張貞發，向 剛，黃 青，連 歡，劉鳳平，黃 唯，周樹年，李許明，李福燕

（廣西民族師范學院化學與生物工程學院，光電化學傳感與區域環境分析實驗室，廣西 崇左 532200）

過氧化氫（HO）作為去色劑等常添加在各種快消食品中，當濃度超出0.7 μmol/L，可能導致蛋白質和DNA的嚴重損傷，進而誘發慢性腎功能衰竭、急性腎損傷等疾病。因此，開發新方法檢測食品中HO含量對食品安全具有重大意義。目前，用于HO檢測的方法包括熒光法、化學發光法、滴定法、比色法、表面增強拉曼光譜和電化學法等。其中，電化學傳感器技術因其靈敏度高、成本低、響應速度快等特點已被廣泛關注。然而，傳感器的靈敏度、選擇性和穩定性等性能與電極表面修飾材料息息相關。

銀納米粒子（AgNPs）造價成本相對較低、毒性低，對HO具有好的催化特質。然而，貴金屬粒子受表面電荷影響易團聚，大量結果顯示粒子粒徑降低到納米尺度，催化劑才能發揮其催化能力。通常采用支撐材料(碳材料、金屬氧化物、金屬有機框架材料等)負載貴金屬克服納米粒子團聚現象。

石墨烯氣凝膠（graphene aerogels，GAs）具有多孔結構。制備過程中，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）的部分含氧官能團被還原，冷凍干燥時，GO之間的氫鍵被削弱，致使機械強度弱化。Zhong Jing和Wan Wenchao等為了提高GAs結構強度，引入機械強度良好的多壁碳納米管（multi walled carbon nanotube，MWCNT），該MWCNT-GA復合材料可使GAs在外力誘導的變形下保持結構完整性。最近，Ryu等在此基礎上引入多巴胺（dopamine，DA）作為交聯劑加固二者化學鍵合。DA在弱堿環境中可以自發地氧化、自聚合在材料表面，形成富含兒茶酚和氨基官能團的聚多巴胺（polydopamine，PDA）層。PDA通過自身攜帶的氨基和羥基將羧基化的MWCNT和GO縮合形成混合氣凝膠（mixed aerogels，MAs），MAs形貌類似“卷心菜狀”，其微觀結構表現為3維（3-dimensional，3D）分層多孔結構，該結構具有良好的機械強度，不易坍塌，穩定性好，尤其能提供優異的傳質通道，已逐步應用于傳感和吸附等平臺。然而，鮮見AgNPs改性的MAs（MAs-AgNPs）復合材料應用于HO電化學檢測的相關報道。

本研究采用回流法化學還原硝酸銀（AgNO）制備AgNPs并負載于MAs，以3D AgNPs-MAs復合材料修飾玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）制備用于食品中HO測定的電化學傳感器。以對HO的電流響應為指標，對AgNPs-MAs-GCE修飾電極的條件進行優化；并與制備的其余修飾電極（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）進行電化學測試及對比分析；使用牛奶樣品對AgNPs-MAs-GCE修飾電極進行實際樣品測試及回收率分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 廣西石埠乳業有限公司；透析袋（截留分子質量3 500 Da） 湖南電禾公司；石墨粉、羧基化MWCNT 南京先豐納米材料科技有限公司；鹽酸DA上海恒斐生物科技有限公司；AgNO、HO國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

CHI760E電化學分析儀 上海辰華儀器有限公司；GCE（直徑3 mm）、鉑柱電極、飽和甘汞電極 天津英科聯合科技有限公司；80-ZB離心機 上海雅榮生化儀器設備有限公司；CTFD-10冷凍干燥機 上海拓紛機械設備有限公司；SU5000場發射掃描電鏡 日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 MWCNT-PDA的制備

參考Ryu等提出的方法。將0.10 g羧基化MWCNT溶于200 mL去離子水，超聲處理30 min使其分散均勻，在攪拌情況下緩慢地加入0.20 g DA。用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液將該混合物的pH值調整為8.5，并在室溫下連續攪拌該懸浮液48 h。5 000 r/min離心5 min，去除上清液，用去離子水和乙醇溶液多次沖洗并進行透析，以完全去除游離的DA。冷凍干燥24 h，最終獲得MWCNT-PDA。

1.3.2 MAs的制備

參考Hummers和Zhan Wenwei等的方法。將GO透析數天，直至溶液pH值趨于中性，冷凍干燥，得到透析后的GO。將MWCNT-PDA∶GO以質量比1∶4溶于一定體積的去離子水，超聲溶解，其中GO質量濃度為2.00 mg/mL。將25 mL混合溶液轉入反應釜，90 ℃反應12 h。將反應產物倒入透析袋，以去離子水和乙醇溶液交替透析數天，液氮冷凍后進行干燥，再在750 ℃以氮氣保護退火3 h，得到MAs。

1.3.3 AgNPs-MAs的制備

參考并改進Shi Lei等的合成技術。將0.040 g AgNO置于小燒杯中，加入20 mL乙二醇，超聲處理0.5 h。加入0.02 g MAs靜置2 h后，在圓底燒瓶中加入0.2 mL水合肼和0.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，保持150 ℃，在油浴鍋中回流4 h。用二次水和乙醇依次清洗、6 000 r/min離心5 min，真空干燥后得到AgNPs-MAs。重復上述步驟制備AgNPs（不加MAs）。

1.3.4 AgNPs-MAs-GCE及其他修飾電極的制備

將AgNPs-MAs分散于,-二甲基甲酰胺，使溶液中AgNPs-MAs質量濃度為1 mg/mL，用移液槍取5 μL復合物溶液滴涂于事先打磨好的GCE表面，自然晾干，得到AgNPs-MAs-GCE修飾電極。此外，其他對比性修飾電極（如AgNPs-GCE和MAs-GCE）的制作程序與此相似。

1.3.5 掃描電鏡和能譜測試

掃描電鏡：掃描探頭為二次電子探頭，掃描電壓10 kV，工作距離8.5 mm，探針電流20 pA。

能譜掃描實驗參數：掃描電壓10 kV，工作距離6.9 mm。

1.3.6 修飾電極的電化學測試

采用電化學阻抗法在5 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中測試不同修飾電極的電化學阻抗表征，偏壓0.2 V，頻率范圍10 000～0.5 Hz，交流振幅5 mV。

采用循環伏安法測試不同修飾電極對HO的電流響應，電壓范圍-0.5～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，HO濃度為10 mmol/L。

采用計時庫侖法在0.1 mmol/L [Fe(CN)]/[Fe(CN)]+0.1 mol/L KCl溶液中測試電量評估AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積，電壓范圍0.25～0.5 V，脈沖寬度0.25 s，圈數為1 圈。

采用計時電流法制作標準曲線，以AgNPs-MAs-GCE為工作電極，最佳測試條件下，保持基線平穩后，向10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中每隔50 s等量添加20 μL 5 mmol/L HO溶液。

采用計時電流法考察電極穩定性，將AgNPs-MAs-GCE修飾電極保存于4 ℃冰箱，每隔10 d在相同條件下測試對HO的電流響應，其中，偏壓-0.4 V，緩沖液為磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），電極修飾液體積5 μL；而AgNPs-MAs-GCE修飾電極的重復性測定，需要修飾3 根相同的電極，測定條件與穩定性保持一致。

采用計時電流法考察AgNPs-MAs-GCE修飾電極的抗干擾性，測試時分3 個環節。首先，滴加HO，其次，滴加干擾物，最后，繼續滴加HO，而測試條件與穩定性保持一致。

1.3.7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的實際樣品測試及回收率分析

采用計時電流法測試實際樣品和回收率，測試前將牛奶于6 000 r/min離心5 min，移取上清液1 mL，將其溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，采用標準加入法進行回收實驗。

1.4 數據處理

每個實驗均重復3 次。使用Zview 3.10軟件對電化學阻抗奈奎斯特圖的數據進行擬合，其他數據使用Origin 8.5軟件進行分析和繪制。

2 結果與分析

2.1 AgNPs-MAs-GCE修飾電極及其材料的掃描電鏡表征

從圖1A～E可以看出，GO褶皺明顯并呈現規則的較大孔洞，這為后續3D MAs的制備提供支撐；MWCNTPDA呈螺旋彎曲，直徑小于50 nm且長度約為1 μm；3D MAs的橫切面呈分層多孔結構，類似“卷心菜狀”；AgNPs直徑為30～50 nm，大小基本均勻，相對分散；AgNPs-MAs復合材料修飾GCE表面特征，發現大量AgNPs負載于MAs中。肉眼觀察MAs呈現圓柱狀，冷凍干燥后，表面粗糙，層狀分布明顯并有大孔（圖1F）。

圖1 GO（A）、MWCNT-PDA（B）、MAs（C）、AgNPs（D）、AgNPs-MAs-GCE（E）掃描電鏡圖和MAs實物圖（F）Fig. 1 Scanning electron microscopic images of GO (A),MWCNT-PDA (B), MAs (C), AgNPs (D), AgNPs-MAs-GCE (E) and pictures of MAs (F)

2.2 AgNPs-MAs復合材料元素圖譜表征分析

由圖2可知，AgNPs-MAs復合材料的主要元素為Ag（紫色）、O（藍色）和C（綠色），相對含量分別為55.64%、2.37%和41.99%。

圖2 AgNPs-MAs的掃描電鏡圖（A）、面掃元素圖（B）和能量色散X射線譜圖（C）Fig. 2 Scanning electron microscopic image (A), scanning electron microscopic elemental mapping image (B), and energy-dispersive X-ray spectroscopic image (C) of the AgNPs-MAs

2.3 不同修飾電極的電化學阻抗表征

將制備的GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE電極分別置于三電極體系中進行電化學阻抗測量，結果如圖3所示。半圓的直徑長度表示高頻電子傳遞的限制過程，而直線部分表示低頻溶液擴散限制過程。采用Zview軟件，進行等效電路擬合（圖4），GCE、AgNPs-GCE、MAs-GCE和AgNPs-MAs-GCE電極的電荷轉移電阻（）分別為955.5、3 342、326.7 Ω和384.8 Ω，說明AgNPs分散于3D MAs多層結構中時，其降為最小值，這更利于電荷轉移。

圖3 不同修飾電極的電化學阻抗圖譜Fig. 3 Nyquist plots of different modified electrodes

圖4 不同修飾電極的等效電路圖Fig. 4 Equivalent circuits for different modified electrodes

2.4 不同修飾電極對H2O2的電流響應分析

如圖5所示，GCE和MAs-GCE在HO溶液中沒有明顯的氧化還原峰，二者電流區別不大；AgNPs-GCE對HO具有催化作用，顯示較強的氧化還原峰；AgNPs-MAs-GCE對HO響應明顯增大，其還原峰電流分別是AgNPs-GCE的1.8 倍和GCE的24.5 倍。這歸因于MAs材料的分層多孔結構方便快速傳質以及分散于該結構中的AgNPs催化協同作用，AgNPs在MAs加持下，大幅度提高催化活性位點的密度性，活性位點與HO在3D空間中充分接觸。

圖5 不同修飾電極的循環伏安圖Fig. 5 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.5 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測試條件優化分析

2.5.1 掃描速率對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學行為的影響

由圖6A可知，在30～110 mV/s掃描速率范圍內，氧化和還原峰電流隨掃描速率的增大而增大，且峰電流與掃描速率的平方根呈正比關系（圖6B），即HO在AgNPs-MAs-GCE電極周圍的電子轉移受擴散控制。

圖6 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同掃描速率下對H2O2電流響應（A）及H2O2峰電流響應與掃描速率平方根的線性關系圖（B）Fig. 6 Current response at different scanning speeds of the electrode AgNPs-MAs-GCE (A) and linear relationship between peak current and square root of scanning speed (B)

2.5.2 pH值對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學行為的影響

如圖7所示，隨著pH值從5.5增至7.4，峰電流依次增加，隨后進入堿性環境，隨著pH值增大峰電流降低。因此，本實驗得到的最優pH 7.4。

圖7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的pH值與峰電流的關系Fig. 7 Relationship between peak current and pH for AgNPs-MAs-GCE

2.5.3 偏壓對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學行為的影響

如圖8所示，隨著偏壓增加，電流響應信號增加，噪音信號也同步增加；偏壓為-0.7 V時，噪音信號明顯擾亂電流信噪。此外，偏電壓太大，傳感器的選擇性會受到挑戰。為了保證傳感器的靈敏性和選擇性，本實驗選擇-0.4 V為工作偏壓。

圖8 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同偏壓下對H2O2的電流響應Fig. 8 Current response to H2O2 at different bias levels of AgNPs-MAs-GCE

2.5.4 修飾液體積對AgNPs-MAs-GCE修飾電極HO電化學行為的影響

如圖9所示，5 μL AgNPs-MAs修飾液會使AgNPs-MAs-GCE電極產生較高的響應信號，其他體積修飾液下的電流響應波動不大，所以本實驗以5 μL為最優AgNPs-MAs修飾液體積。

圖9 AgNPs-MAs-GCE修飾電極在不同修飾液體積下H2O2電流響應Fig. 9 Current response to H2O2 at different volumes of modified electrode solution of AgNPs-MAs-GCE

2.6 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積分析

采用計時庫侖法測試修飾電極AgNPs-MAs-GCE在0.1 mmol/L [Fe (CN)]溶液中電量和時間的關系，計算修飾電極的有效面積。參考公式如下：

式中：為電荷量；為電極有效面積；為溶液中的初始摩爾濃度；為電子的轉移數量；為法拉第常數（96 480 C/mol）；為電解時間；為擴散系數（7.610 6 cm/s）；為雙層電荷；為Faradaic電荷。

如圖10所示，AgNPs-MAs-GCE和GCE電極的擬合曲線方程分別是＝19.2+0.69（＝0.992 6）和＝6.86+0.13（＝0.998 3），根據其斜率，得到AgNPs-MAs-GCE修飾電極的有效面積是裸GCE的2.8倍，說明修飾材料有可能在實驗中起到富集作用增大電流響應。

圖10 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的電量與時間關系曲線（A）、電量與時間平方根的線性關系圖（B）Fig. 10 Charge versus time curve for AgNPs-MAs-GCE (A), and linear relationship between charge and square root of time (B)

2.7 AgNPs-MAs-GCE修飾電極對H2O2標準曲線的建立

如圖11所示，隨著電解池中HO濃度的增加，峰電流有規律地攀升且峰電流與HO濃度成呈良好線性關系，其線性方程為＝0.32+1.66（＝0.999 3），線性范圍為9.98～136 μmol/L，檢出限0.02 μmol/L（信噪比為3）。該傳感器的靈敏性高于目前文獻報道值，如表1所示。高靈敏性可能歸功于：以3D分層多孔結構的復合材料修飾電極能明顯增大被測物接觸空間，改善了目標離子的傳質效率；分散的AgNPs提供了足夠的識別位點并增強了響應信號的接收。

圖11 連續滴加H2O2的計時電流響應曲線（A）及電流與H2O2濃度的線性關系（B）Fig. 11 Amperometric response curves of AgNPs-MAs-GCE with successive addition of H2O2 (A), and linear relationship between peak current and concentration of H2O2 (B)

表1 基于類似納米材料的電化學傳感器H2O2檢測性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of electrochemical sensors based on similar nanomaterials for H2O2 detection

2.8 AgNPs-MAs-GCE修飾電極的穩定性和重復性分析

如圖12所示，第30天該修飾電極的響應電流比第1天降低18.4%，電極活性保持在81.5%以上，而3 根AgNPs-MAs-GCE電極的相對標準偏差分別為1.52%、3.2%和3.1%。以上數據顯示該修飾電極構建的HO電化學傳感器具有較好的穩定性和重復性。

圖12 AgNPs-MAs-GCE電極的穩定性和重復性Fig. 12 Stability and repeatability of AgNPs-MAs-GCE

2.9 AgNPs-MAs-GCE電極的抗干擾性分析

如圖13所示，向磷酸鹽緩沖液等時間、等體積地添加20 μL 5 mmol/L HO后，發現電流響應隨添加次數依次增加；依次添加等濃度的干擾物鹽酸DA、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、尿酸（uric acid，UA）、色氨酸（tryptophan，Try）、檸檬酸（citric acid，CA）和抗壞血酸（ascorbic acid，AA）于電解池，發現只有UA對應的電流有輕微浮動，其余干擾物對應的電流幾乎沒有增加；最后繼續添加HO，發現電流響應并未受電解池測試環境的影響，依然隨HO添加次數而增加。因此，該修飾電極構建的HO電化學傳感器具有良好的抗干擾能力。

圖13 AgNPs-MAs-GCE電極的抗干擾能力Fig. 13 Anti-interference capacity of AgNPs-MAs-GCE

2.10 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測量的回收率分析

如表2所示，牛奶樣品的回收率在98.1%～98.8%之間，相對標準偏差為0.58%～2.28%。說明該方法建立的傳感器回收率高，實驗數據準確度高，有望用于檢測實際樣品。

表2 AgNPs-MAs-GCE修飾電極測定牛奶樣品回收率Table 2 Recoveries of H2O2 spiked in milk samples using AgNPs-MAs-GCE

3 結 論

以3D MAs負載AgNPs制備高穩定性和傳質效率優異的分層多孔復合材料修飾GCE構建AgNPs-MAs-GCE電化學傳感器并采用計時電流法檢測HO。隨著HO濃度的增加，峰電流與濃度呈良好線性關系，其線性方程為＝0.32+1.66（＝0.999 3），線性范圍9.98～136 μmol/L，檢出限0.02 μmol/L（信噪比為3）。該傳感器保存至第30天時，該修飾電極的活性保持在81.5%以上，重復性的相對標準偏差低于3.2%，對于實際樣品的回收率保持在98.1%～98.8%之間，實驗結果表明，該傳感器有望用于食品中HO的高靈敏性檢測。此外，該傳感器也存在一些不足，不能同時檢測多種組分，若將計時電流法與原位拉曼技術或微流控技術結合，有望同時檢測多種組分。