FOXP3與宮頸癌發病風險及預后生物信息學

石鳳 王俊利 董明右 龐曉霞 李光景 韋瑩慧

(右江民族醫學院 1附屬醫院生殖醫學中心，廣西 百色 533000；2醫學檢驗學院臨床血液學與形態學教研室)

宮頸癌(CESC)包括宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌，主要為宮頸鱗狀細胞癌，占70%以上〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)感染，性生活，衛生條件，遺傳因素及基因突變等是促進CESC發生的危險因素，其中長期高危型HPV感染是引起CESC的主要發病機制。近年來，HPV疫苗的使用降低了CESC的發生率〔2〕。然而，由于其覆蓋率及費用，相對于發達國家而言，中低收入國家的CESC患病率高達四倍〔3〕。世界衛生組織報道CESC的發病率和死亡率有下降趨勢，但每年仍有750 000例新增病例數〔4〕。迄今為止，CESC仍是嚴重威脅女性身心健康的婦科腫瘤之一。

叉頭/翼狀螺旋轉錄家族因子(FOXP)3定位于X染色體Xp11.23，含有11個編碼外顯子，屬于FOX家族蛋白，特征性地表達于調節性T細胞(Treg)，參與Treg細胞的增殖、分化和成熟，控制Treg細胞的基因表達和轉錄。FOXP3是一種多結構域蛋白，氨基酸端包含亮氨酸拉鏈、鋅指蛋白和阻遏結構域，羧基端包含叉頭DNA結合結構域，FOXP3與Treg細胞啟動子區域結合調節Treg細胞的基因表達，影響其轉錄水平，對誘導和維持Treg細胞獨特的免疫抑制特性至關重要〔5〕。近年來，越來越多的證據表明FOXP3在癌癥中發揮重要作用〔6〕。本研究旨在通過生物信息學分析FOXP3在不同組織中的表達及與癌癥的關系，探討FOXP3表達水平對CESC患者總體生存率的影響。

1 材料與方法

1.1數據獲取 從UCSC Xena官網(https://xena.ucsc.edu/)提取33個腫瘤的TCGA數據，包括經FPKM是經校正后的轉錄組數據信息；基因突變信息和生存信息。所有的研究數據來源于TCGA公共數據庫，該數據庫數據對外開放，因此，不需要相關醫學倫理委員會批準。

1.2FOXP3與CESC臨床特性的相關性 通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在線數據庫分析FOXP3在正常組織和腫瘤組織中的表達情況，并比較分析FOXP3表達水平與癌癥患者臨床特征的相關性，包括分級、種族、體重、年齡和淋巴結轉移。

1.3COX回歸分析CESC患者生存分析 通過FOXP3表達水平中位值將CESC患者分為兩組，分別為高表達FOXP3組和低表達FOXP3組。采用COX回歸分析FOXP3基因表達水平與CESC患者總體生存率的關系。

1.4FOXP3與腫瘤免疫細胞的相關性 輸入癌癥的基因轉錄組數據，通過R3.6.0的“estimate”包對CESC轉錄組數據進行免疫細胞得分和基質細胞得分。進一步通過生物信息學分析在CESC中，FOXP3與免疫細胞的相關性，包括樹突細胞、巨噬細胞、肥大細胞、單核細胞、中性粒細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和Treg的相關性。

1.5統計學處理 通過Perl軟件對TCGA腫瘤轉錄組數據的基因編號轉化為基因名字，對通過Wilcox秩和檢驗比較FOXP3在正常組和CESC組及臨床特征的差異，通過Kaplan-Meier繪制FOXP3表達水平與CESC患者的生存曲線。通過Spearman檢驗分析FOXP3與免疫細胞浸潤的相關性，本研究檢驗結果均通過R3.6.0程序計算所得。

2 結 果

2.1FOXP3在腫瘤組織中的表達 將下載的TCGA轉錄組數據，通過Perl命令提取所需要的輸入文件，包括基因名稱、FOXP3在腫瘤組織中的表達水平、組織類型和腫瘤類型。通過R3.6.0語言的“ggpubr”包對FOXP3在腫瘤組織和正常組織中的表達繪制箱線圖，結果如圖1所示，FOXP3在膀胱癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、CESC、結腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、頭頸部癌(HNSC)、腎透明細胞癌(KIRC)、肺磷癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)和子宮內膜癌(UCEC)中表達升高，并且與正常組織相對差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2FOXP3與CESC臨床特征的分層分析 根據以上結果顯示，FOXP3在CESC中的表達相對于正常組織顯著升高，為了進一步探討FOXP3在CESC亞組中的相對表達信息，本研究通過UALCAN網站進行分層分析。研究結果顯示：FOXP3在CESC中的表達水平〔1.999(1.000～3.845)〕顯著高于正常組〔0.234(0.148～0.317)，P<0.001〕；CESCⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級的FOXP3表達水平〔2.181(1.193～3.862)、2.392(0.944～4.674)、1.465(0.998～3.585)、1.028(0.602～1.913)〕均高于正常組(P<0.001)，Ⅰ級和Ⅱ級的表達水平高于Ⅲ級和Ⅳ級(圖2)；并隨著淋巴結轉移，FOXP3在CESC中表達呈上升趨勢〔未轉移2.355(1.297～4.341)、轉移2.514(0.925～3.678)〕；FOXP3在非裔美國CESC患者中的表達水平〔2.917(1.410～4.901)〕明顯高于高加索患者〔1.973(0.977～3.487，P<0.001〕，非裔美國CESC患者FOXP3表達水平高于亞洲患者〔1.665(1.038～4.113)〕，但差異無統計學意義。此外，FOXP3在CESC患者中的表達水平還與患者體重和肥胖有關〔正常體重1.872(0.938～3.467)、超重2.264(1.060～3.599)、肥胖1.942(1.116～2.796)、超肥1.499(1.071～3.822)，P<0.001〕，并隨著年齡的增加，FOXP3在CESC中的表達水平呈上升趨勢〔≤40歲1.842(1.042～2.838)、41～60歲1.949(0.943～3.499)、61～80歲2.460(1.248～3.933)，均P<0.001；>80歲0.540(0.401～3.692)，P=0.394〕。

2.3FOXP3的表達水平與CESC患者的生存率 通過來自TCGA數據庫的臨床信息，本研究將FOXP3在不同腫瘤中的表達水平根據均值將FOXP3分為高表達組和低表達組，使用R語言的“COX”包計算FOXP3表達水平與CESC患者總體生存率的影響，繪制生存曲線圖和森林圖。如圖2所示，FOXP3高表達組增加CESC患者的總體生存率(P=0.004)，表明在CESC患者中，FOXP3表達水平高的患者預后較好。

2.4FOXP3與腫瘤的腫瘤突變負荷(TMB)和微衛星不穩定性(MSI) TMB和MSI是多種腫瘤的有效預后標志物和免疫治療反應指標。本研究通過R3.6.0繪制雷達圖對泛癌進行TMB和MSI分析，如圖3所示，本研究未發現FOXP3與CESC的TMB和MSI有關。

2.5FOXP3與免疫細胞浸潤 通過R3.6.0語言的“estimate”包計算FOXP3來自TCGA數據庫中CESC的免疫細胞得分和基質細胞得分。研究發現：FOXP3與CESC免疫細胞得分呈正相關(r=0.78，P<0.001)；FOXP3與CESC基質細胞得分呈正相關(r=0.56，P<0.001)。進一步分析FOXP3表達水平與免疫浸潤細胞的相關性。發現FOXP3表達水平與CESC中的B細胞(r=0.546，P<0.001)、樹突細胞(r=0.494，P<0.001)、巨噬細胞(r=0.302,P<0.001)、中性粒細胞(r=0.409,P<0.001)、CD4+T細胞(r=0.478,P<0.001)、CD8+T細胞具有顯著相關性(r=0.327,P<0.001)。

ACC:腎上腺皮質瘤; CHOL:膽管癌; DLBC:彌漫大B細胞淋巴瘤; GBM:膠質母細胞瘤;KICH:腎細胞癌; KIRP:腎乳頭狀細胞癌; LAML:急性粒細胞白血病; LGG:低級別腦膠質瘤;LIHC:肝細胞癌; LUAD:肺腺癌;MESO:間皮瘤; OV:卵巢漿液性囊腺癌;PAAD:胰腺癌; PCPG:嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤; SARC:肉瘤; SKCM:皮膚黑色素瘤; TGCT:睪丸生殖細胞瘤; THCA:甲狀腺癌; THYM:胸腺瘤; UCS:子宮癌肉瘤; UVM:葡萄膜黑色素瘤。藍色：代表FOXP3在正常組織中的表達量；紅色：代表FOXP3在腫瘤組織中的表達量；1)P<0.05；2)P<0.01，3)P<0.001，圖3同圖1 FOXP3在腫瘤組織中表達

左：FOXP3表達水平與CESC總體生存率；右：FOXP3表達水平與泛癌總體生存率森林圖圖2 FOXP3表達水平與腫瘤的總體生存率

TMB：是指每一百萬個堿基中有多少個堿基發生突變；MSI：是指每百萬堿基中重復序列的缺失或插入的總發生率圖3 FOXP3表達水平與泛癌的TMB和MSI的相關性

3 討 論

近年來，隨著CESC篩查手段的普及及HPV疫苗的廣泛使用，CESC的發病率和死亡率有下降趨勢，但每年仍有多數女性患者死于CESC〔7〕。本研究結果顯示：FOXP3表達水平與CESC患者腫瘤分期和淋巴結轉移密切相關，FOXP3在非裔美國CESC患者中的表達水平顯著高于高加索患者，此外，過度肥胖和超重CESC患者的FOXP3表達水平相對于正常體重患者顯著升高，并隨著患者年齡增長，其表達水平逐漸升高，而由以上結果顯示，年齡81～100歲的CESC患者表達水平反而降低，可能是由于其該年齡段的CESC患者樣本量太小所致，由以上研究結果發現FOXP3表達水平升高促進CESC的發生。結果顯示FOXP3表達水平越高，CESC患者的總體生存率越好。經查閱文獻，發現相似的研究結論也存在于其他癌癥中。Seminerio等〔8〕發現FOXP3在頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)患者的間質細胞中的表達明顯高于實體腫瘤，并且FOXP3表達水平越高，HNSCC患者的預后越好。Kuwahara等〔9〕發現FOXP3高表達提高結直腸癌患者的預后。然而，在一項關于FOXP3與宮頸鱗狀細胞癌的研究中，高浸潤FOXP3與CESC患者的預后不良有關〔10〕，但在宮頸腺癌中，FOXP3表達水平越高，預后越好〔11〕。與宮頸鱗狀細胞癌的結果相反。由此可見，FOXP3與癌癥預后、腫瘤部位、組織類型密切相關。

TMB和MSI兩者有效反映腫瘤的預后生物標志物和治療指標。在本研究中，尚未發現FOXP3表達水平與宮頸癌TMB和MSI的相關性，但在HNSCC和LUSC等腫瘤中，FOXP3表達的水平與TMB和MSI顯著相關。FOXP3是Treg細胞最具特征性的標志物，在自身免疫性疾病和腫瘤免疫逃逸中起著重要的作用〔12〕。

綜上，FOXP3在CESC中表達水平相對于正常組明顯升高，然而在CESC組中，FOXP3表達水平越高，總體生存率越好。一項關于FOXP3與癌癥預后的meta分析研究顯示：FOXP3在大多數腫瘤中的預后差，對胰腺癌和卵巢癌的預后無影響，而HNSC、結直腸癌和ESCA中，FOXP3的浸潤與預后良好有關〔13〕。本研究通過生物信息學研究FOXP3對CESC預后的影響與Shah等〔10〕研究者的結論存在爭議，可能是樣本來源、組織類型等因素的影響。本研究存在以下不足：研究數據均來自TCGA公共數據庫，人群選擇，組織類型等異質性大，未進行臨床樣本實驗驗證，可能與其他研究存在爭議。