U0126對食管鱗癌細胞遷移的影響

劉丹輝 齊博 劉玉珍 陳智 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 1第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 衛(wèi)輝 453100；2食管癌研究所；3第一附屬醫(yī)院生命科學研究中心)

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，主要分鱗癌與腺癌兩大病理類型，在中國90%以上為食管鱗癌患者〔1〕。盡管目前對于食管癌的診療已經有了顯著進步，如手術、化療、放療等，但由于高復發(fā)和轉移的特性，其預后依然很差。細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)作為絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，調控細胞內的多種信號分子發(fā)揮生物學效應〔2〕。ERK通過活化核因子κB等途徑誘導抗凋亡基因的表達，促進凋亡蛋白的降解，促進腫瘤細胞的增殖、抑制其凋亡；絲裂原細胞外信號調節(jié)激酶(MEK)作為ERK的激酶，引起ERK磷酸化的發(fā)生。應用MEK抑制劑抑制ERK磷酸化(磷酸化ERK為ERK活化形式)，誘導細胞凋亡與周期阻滯，對不同類型的神經母細胞瘤、肝癌、結直腸癌等多種腫瘤細胞表現(xiàn)出抑制生長、促進凋亡的作用〔3～5〕。在腫瘤遷移及侵襲方面，ERK通過活化轉錄因子激活蛋白(AP)-1等促進細胞外基質的降解，利于腫瘤細胞的遷移，抑制ERK活性后腫瘤細胞的遷移及侵襲能力顯著被抑制〔6〕。然而，臨床試驗發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑治療某些腫瘤并不能提高患者5年生存率，且有研究報道MEK抑制劑具有促進乳腺癌細胞遷移的作用〔7〕。目前有關MEK抑制劑對食管鱗癌細胞遷移的影響及其作用機制，國內外尚無相關報道。本研究旨在分析MEK抑制劑U0126對食管鱗癌細胞遷移的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人食管癌細胞系KYSE-150購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，使用RPMI1640(含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液)培養(yǎng)細胞。MEK抑制劑U0126購自美國APExBIO公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天公司，放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購自博士德公司，Transwell小室購于美國 Corning 公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司(1∶8 000)，磷酸化(p)-ERK1/2、E-鈣黏蛋白(cadherin)、β-連環(huán)蛋白(catenin，1∶1 000)抗體購自美國CST公司，GADPH(1∶1 000)抗體購自武漢博士德公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) KYSE-150細胞，使細胞呈單層貼壁生長，每3 d傳代一次。 U0126處理KYSE-150細胞，使其終濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L。

1.3Transwell細胞遷移實驗檢測細胞垂直遷移能力 取對數(shù)生長期細胞，用無血清的培養(yǎng)基RPMI1640重懸細胞(濃度為5.0×105/ml)，取200 μl(含細胞數(shù)1.0 × 105個)加入Transwell上室中，在下室加入600 μl含10% 胎牛血清培養(yǎng)基，將小室放入培養(yǎng)板中。分為0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L的 U0126組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的結晶紫對下室底部細胞進行染色，并用棉簽除去上室內側的細胞。最后顯微鏡下觀察細胞，取9個不同視野進行拍照計數(shù)，統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.4劃痕實驗檢測細胞水平遷移能力 將細胞密度為5.0×105/ml 的細胞懸液加入6孔板中，在37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，經不同濃度U0126處理，在細胞上用200 μl 的槍頭劃橫線三條繼續(xù)培養(yǎng)。藥物分別處理24 h、48 h后取出細胞，顯微鏡下觀察細胞橫向遷移情況，并在相同位置拍照。

1.5Western印跡實驗 分別收集0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白。按每孔20 μg蛋白制備蛋白樣品、上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。經5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后，加入相應的一抗稀釋液，4℃ 孵育過夜。回收一抗，TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗，室溫孵育70 min，TBST清洗3次，電化學發(fā)光(ECL)法顯影，采用凝膠成像設備觀察結果并拍照，用ImagegJ 18.0圖像分析軟件測條帶灰度值并比較各組間差異。

1.6統(tǒng)計學分析 采用Graphpad prism7軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1U0126對食管鱗癌細胞垂直遷移的影響 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理組的細胞穿膜細胞數(shù)〔(83.33±9.00)個、(240.00±2.49)個、(314.00±2.94)個〕較0.0 μmol/L U0126(對照)組〔(115.00±7.12)個〕明顯增加，且處理組穿膜細胞數(shù)目隨U0126濃度的增高而增加(P<0.01)。見圖1。

圖1 U0126對KYSE-150細胞垂直遷移的影響(結晶紫染色，×200)

2.2U0126對KYSE-150細胞水平遷移的影響 U0126促進KYSE-150細胞遷移，且隨著U0126濃度及時間的增加，促進效應逐漸增強。0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理細胞24、48 h后橫向遷移細胞數(shù)高于對照組除0.5 μmol/L 24 h時外，其余差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1和圖2。

表1 U0126對KYSE-150細胞水平遷移的影響個，n=3)

圖2 U0126對KYSE-150細胞水平遷移的影響(×200)

2.3U0126對KYSE-150細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理組 E-cadherin蛋白表達量明顯低于對照組，而 β-catenin蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.01)，0.5、1.0 μmol/L U0126與p-ERK1/2表達較對照組無明顯改變，但2.5 μmol/L U0126抑制p-ERK1/2表達(P<0.01)。見圖3和表2。

1～4：對照組，0.5 μmol/L U0126組，1.0 μmol/L U0126組，2.5 μmol/L U0126組圖3 U0126對KYSE-150細胞相關蛋白表達的影響

表2 U0126對KYSE-150細胞相關蛋白表達的 影響

3 討 論

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，且預后差，是世界上最常見的第8大惡性腫瘤，中國90%以上為食管鱗癌患者〔8〕。由于食管癌具有高度侵襲性且易發(fā)生早期轉移，其5年生存率不到20%。盡管許多抗腫瘤藥物能抑制食管癌的進展，但有些患者治療效果依然很差，其原因有待進一步闡明。Ras/MEK/ERK通路對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等方面起著關鍵作用〔9～16〕。因此，ERK被認為是治療癌癥的合適靶點〔17〕。ERK活化促進癌細胞增殖，抑制凋亡，針對調控ERK的上游激酶的抑制劑，已被研發(fā)應用于臨床試驗。通過應用ERK激酶MEK抑制劑進而抑制ERK信號通路，抑制ERK磷酸化的發(fā)生，促進腫瘤細胞凋亡。例如，鈣結合蛋白S100A12上調前列腺癌細胞ERK磷酸化水平，具有明顯抗凋亡能力，MEK抑制劑MK-8353明顯逆轉該現(xiàn)象的發(fā)生〔18〕。此外，ERK磷酸化可通過調控轉錄因子的表達，利于EMT現(xiàn)象的發(fā)生，促進腫瘤細胞的遷移及侵襲能力。EMT即上皮到間質細胞的轉化，通過修飾細胞表達的黏附分子，從而使其具有遷移和侵襲行為。上皮標志物E-cadherin和間充質標記物β-catenin、vimentin等均為EMT的標志蛋白，上皮標志物的下調與間充質標志物的上調預示著腫瘤細胞EMT現(xiàn)象的發(fā)生。Zheng等〔19〕研究證實鈣蛋白酶家族成員Capn4通過ERK/c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化激活AP-1，促進鼻咽癌細胞遷移。ERK磷酸化水平上調，促使胰腺癌細胞EMT的發(fā)生，抑制ERK磷酸化水平上調E-cadherin的表達，下調vimentin的表達，降低胰腺癌細胞的遷移能力〔20〕。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑PD98059通過EGFR信號的激活刺激β-catenin核積聚進而促進乳腺癌細胞遷移〔7〕。

已有文獻報道10 μmol/L U0126對食管鱗癌細胞增殖無影響，但隨著濃度的增加，其對食管鱗癌的增殖抑制作用明顯增強〔21〕。前期通過對不同食管鱗癌細胞檢測發(fā)現(xiàn)，U0126小于10 μmol/L對KYSE-450、EC9706細胞的遷移均無影響，但卻明顯促進KYSE-150細胞遷移。因此本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)，MEK1/2抑制劑U0126以時間-劑量依賴性的方式抑制食管鱗癌KYSE-150細胞的遷移。

β-catenin通常作為關鍵的轉錄因子，促進腫瘤細胞的增殖和遷移〔22〕。β-catenin可通過上調基質金屬蛋白酶(MMPs)在內的轉移相關基因轉錄而促進腫瘤細胞運動能力的增強〔23〕。雖然β-catenin高表達發(fā)生在應用MEK抑制劑后，但是有研究表明，該現(xiàn)象的發(fā)生主要在于MEK抑制劑誘導EGFR信號通路的激活有關，與經典的RAF/MEK/ERK通路介導的細胞增殖、凋亡及遷移、侵襲無相關性〔7〕。由此提示，U0126影響食管鱗癌KYSE-150細胞的遷移可能不僅與調控ERK活性的基本作用有關，且還有可能通過非經典的ERK途徑發(fā)揮作用。

綜上，U0126可能是通過下調E-cadherin和上調β-catenin表達，誘導EMT的發(fā)生，促進KYSE-150細胞遷移。該研究為臨床試驗應用MEK抑制劑治療某些腫瘤效果不理想做出合理解釋，提示臨床用藥過程中不僅要考慮到用藥個體化，還要考慮到用藥的劑量，以此為臨床抗癌藥物的應用提供一定的理論指導。