養(yǎng)肺保元湯調(diào)節(jié)Samd表達改善大鼠慢性阻塞性肺疾病合并肺間質(zhì)纖維化

吳俁 劉良麗 朱曉龍

(貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽 550000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，世界衛(wèi)生組織預(yù)測2030年，COPD將成為全球第三位的致死原因，COPD給全世界所帶來的經(jīng)濟負擔將列為所有單病種排位的第五位〔1，2〕。肺間質(zhì)纖維化(PIF)是以肺泡壁為主，包括肺泡周圍組織及其相鄰支氣管結(jié)構(gòu)發(fā)生病變的一組疾病群，臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難或刺激性干咳〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)和肺泡纖維化是COPD病變向肺組織深處發(fā)展的結(jié)果，PIF是COPD發(fā)展的必然趨勢和病理結(jié)局〔5〕。COPD合并PIF后，患者會出現(xiàn)更加嚴重的缺氧和肺部高壓癥狀，預(yù)期的生存年限中位數(shù)也會降低至6年〔6，7〕。因此抑制COPD向合并纖維化發(fā)展有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad通路是調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵通路，TGF-β1/Smad通路上調(diào)會促進成纖維細胞分化和遷移，在腎臟、肝臟和PIF的研究中都發(fā)現(xiàn)了TGF-β1/Smad通路異常激活的情況〔8～10〕。本研究以COPD合并PIF大鼠模型為研究對象，檢測養(yǎng)肺保元湯(YFBY)對PIF的抑制作用，探討YFBY對TGF-β1/Smad通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SD大鼠，雄性，重250～300 g，15只〔SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司〕、香煙、YFBY(黃芪30 g、黨參 15 g、生地黃15 g、熟地黃15 g、太子參15 g、麥冬15 g、當歸15 g、淮山藥15 g、川芎10 g、茯苓15 g、炒白術(shù)15 g、甘草3 g等，由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，用上述組方500 g加水1 000 ml煎煮 2遍，合并煎液為100 ml)。

1.2主要試劑 蘇木素染液、伊紅染色液(BOSTER)；TUNEL檢測試劑盒(碧云天)；大鼠TGF-β1試劑盒〔酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)〕；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋)；Rabbit Anti-Smad2、Rabbit Anti-Smad3、Rabbit Anti-Smad7(Abcam)。

1.3COPD合并 PIF造模 12只大鼠于自制60 cm×50 cm×40 cm的有機玻璃吸煙箱吸煙，吸煙量為5支/次，每天1次，每次吸煙時間為1 h，共計42 d。

1.4實驗分組和給藥 15只SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分成正常對照組(Normal組)3只、COPD合并PIF模型對照組(Model組)4只、COPD合并PIF+YFBY(YFBY組)4只。除Normal組外進行COPD合并PIF造模，造模結(jié)束后開始給藥，為期1個月。YFBY組每天灌胃養(yǎng)肺保元湯，3次/d，每次3 ml；而Model組每天灌胃生理鹽水，3次/d，每次3 ml。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 樣本用甲醛固定完畢后，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木素水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片，鏡檢。

1.6TUNEL染色 將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟，水化。將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加 50 μg/ml Proteinase K工作液，37℃反應(yīng)30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。每個樣本上滴加足夠量的TUNEL檢測液，45℃避光孵育2 h。PBS洗滌3次。封片，鏡檢。

1.7ELISA檢測 血漿樣品直接進行檢測。根據(jù)大鼠TGF-β1試劑盒說明書進行加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止、測定等操作。用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品實際濃度。

1.8Western印跡檢測 取組織液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入一EP管中，冰上裂解30 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性，上樣，進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳1～2 h后濕法轉(zhuǎn)膜2 h。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加電化學發(fā)光(ECL)曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1YFBY對TGF-β1/Smad 通路的影響 與Normal組比較，Model組Smad2、Smad3、Smad7水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，YFBY組Smad2、Smad3水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。Normal組、Model組、YFBY組TGF-β1水平〔(16.80±1.286,17.01±0.864,16.62±1.640)ng/ml〕無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組肺組織中Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達

表1 肺組織中Smad2、Smad3和Smad7與內(nèi)參 GAPDH相比的蛋白相對表達量

2.2YFBY對大鼠COPD合并PIF的治療效果 相比于Normal組〔(11.00±1.00)個〕，Model組肺泡變小，肺泡間質(zhì)增厚有炎性細胞浸潤，組織中有更多細胞凋亡。YFBY組肺泡間質(zhì)增生程度〔每個視野的TUNEL陽性細胞數(shù)(19.67±3.51)個〕顯著低于Model組〔(51.33±14.01)個，P<0.05〕，細胞凋亡也低于Model組。見圖2。

藍色為細胞核，綠色為凋亡細胞圖2 各組肺部組織

3 討 論

吸煙是COPD的首要誘因〔11〕。TGF-β1/Smad通路上調(diào)會促進細胞增殖抑制細胞凋亡，尤其對成纖維細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有顯著誘導(dǎo)作用，最終導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的組織纖維化，特發(fā)性PIF就是一種典型病癥〔9，12〕。TGF-β1/Smad 通路中TGF-β1是激活通路的細胞因子，而Smad則是一類受TGF-β受體激活的信號蛋白〔13〕。Smad2和Smad3被激活后會從TGF-β受體轉(zhuǎn)移至細胞核，引發(fā)促纖維化基因過表達〔14〕。Smad7的表達同樣受Smad2和Smad3誘導(dǎo)，但是Smad7主要起著抑制TGF-β受體活性的功能，從而達到抑制TGF-β1/Smad通路的效果〔15〕。本研究結(jié)果說明COPD合并PIF造模會上調(diào)肺組織中TGF-β1/Smad通路，而HE染色結(jié)果中PIF水平和TGF-β1/Smad通路激活水平相應(yīng)，可以推測YFBY抑制PIF的療效與TGF-β1/Smad通路激活水平相關(guān)。