AMPK信號通路在中老年肺癌患者惡性質胸腔積液中表達及臨床意義

文榮 王翠峰 張智燕 任美英

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院檢驗科，內蒙古 包頭 014010)

通常在正常人體肺臟層胸膜和壁層胸膜之間有5～15 ml液體，在呼吸運動中起潤滑作用，當循環障礙、炎癥刺激，尤其腫瘤轉移時胸膜腔就可形成大量液體，導致胸腔積液的發生。臨床診斷胸腔積液的方法中，輔助檢查以實驗室檢查最為常見，其檢查項目包括胸腹水的脫落細胞學檢查、免疫組化病理學檢查，但目前仍無十分明確的診斷方法，故存在一定假陰性率〔1,2〕，因此探尋敏感性和高特異度的早期診斷方法就顯得尤為重要。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路作為細胞能量感受器，任一環節出現問題都會導致腫瘤的發生發展〔3〕，肝激酶(LK)B1是AMPK的上游激酶，它對細胞的有效調控是其抑制腫瘤發生發展的重要原因；LKB1-AMPK負向調控某些重要的信號通路，如哺乳動物雷帕霉素蛋白等。本研究探明AMPK信號通路對中老年腫瘤患者胸腔積液表達的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 2017～2019年包頭醫學院第一附屬醫院呼吸科及胸外科門診及住院病人，具有完整的病例資料中老年肺癌患者的胸腔積液標本120例，均為未接受任何治療前采集的胸水。結合臨床資料從中篩選出惡性胸腔積液78例，良性胸腔積液42例，所有病例經組織活檢及細胞學檢查確證。其中男85例，女35例，年齡50～71〔平均(58.5±13.1)〕歲，所有患者簽署知情同意書。

1.2實驗試劑 細胞染液試劑盒：購自南京三生生物公司；實時熒光定量RT-PCR試劑盒(購自天津生物芯片技術有限責任公司；引物：由Invitrogen賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成；蛋白印跡抗體：LKB1、AMPKα1、AMPKα2、p-AMPK抗體均購自Invitrogen賽默飛世爾科技(中國)有限公司，二抗購自美國CST公司。

1.3標本處理 分別收集良、惡性胸腔積液標本80 ml，分裝于不同離心管中并做標識，以2 000 r/min離心10 min，留取細胞沉淀。分別于4℃冰箱和-80℃冰箱保存，用于脫落細胞學檢查、RT-PCR及Western印跡實驗。

1.4脫落細胞學檢查 將良、惡性胸腔積液分組后離心留取沉淀，制作細胞涂片，用瑞吉(瑞氏-吉姆薩)染色法進行細胞染色。由高年資細胞組專家在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并做出良、惡性胸腔積液的判斷。

1.5判斷依據 (1)良性胸腔積液：顏色多為淡黃色或乳白色，主要以白細胞、吞噬細胞等非上皮細胞為主，偶見間皮細胞小團，其形態呈圓形或卵圓形。(2)惡性胸腔積液：顏色大部分以血性或洗肉水色多見，腫瘤細胞形態畸形，核質比增大，染色深，可見乳頭狀、桑葚狀排列，見圖1。

1.6實時熒光定量PCR檢測基因表達 從-80℃冰箱取出良惡性組胸腔積液標本，待充分融化后以3 500 r/min離心10 min，棄去上清，留取下層細胞沉淀。用Trizol提取液提取各組胸水總RNA，并計算RNA 濃度，應用RT-PCR將其反轉錄成cDNA。反應條件第一步:50℃ 2 min；第二步：97℃ 2 min；第三步:96℃ 10 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s；第四步：70℃ 2 min,共35個循環，實驗重復3次。引物序列如下：AMPKα1：上游：5′-CAGCTTGCAGTGGCTTATCA-3′，上游：5′-CAGTTCATCCAATGGACATC-3′；AMPKα2：上游5′-CGCTGTCATCGCTTTATCG-3′，下游：5′-ATGCTCAGACACCTCCACC-3′；LKB1上游：5′-TGGTTCCGGAAGGAACATCCC-3′，下游：5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；β-actin上游：5′-TC-CCTGAAGAAGAGCTACGA-3′，下游：5′-AGCACTGTGGTGGCGTACAG-3′。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態學(×20)

1.7Western印跡方法檢測蛋白水平表達 將良惡性胸腔積液標本分組后分別取80 μl放入EP管中并做好標記。用蛋白裂解液裂解兩組細胞，提取總蛋白。輕取蛋白樣品95C°至完全變性，再進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5% 牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1 h。之后將PVDF膜分別與AMPKα1(1∶1 000)、AMPKα2(1∶1 000)、p-AMPK(1∶2 000)、LKB1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜。待一抗孵育結束后，室溫搖床上用TBST洗膜3次，每次10 min。加入稀釋辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶4 000)37℃室溫孵育2 h，用電化學發光(ECL)法顯影，曝光5～10 min。后用Image J軟件分析兩組蛋白條帶的灰度值，與內參灰度值比值即為該蛋白含量。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism7.0軟件進行t檢驗。所有Real-time數據mRNA相對值以ΔΔCt值表示：ΔΔCt=2-ΔΔCt。

2 結 果

良、惡性胸腔積液組LKB1 AMPKα1、AMPKα2 mRNA相對表達量、LKB1、p-AMPK蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05，P<0.001)，見表1，圖2。

表1 良惡性胸腔積液LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白和mRNA及p-AMPK蛋白表達

圖2 良惡性胸腔積液中LKB1、AMPKα1、AMPKα和 p-AMPK蛋白表達

3 討 論

肺癌對人類健康和生命存在極大危害，發生機制較為復雜。胸腔積液是常見的臨床癥狀，對其類型的明確診斷對于臨床病情評估和對癥治療尤為重要。AMPK信號傳導通路被稱之為“細胞能量感受器”〔4〕，可感受腺苷-磷酸/腺苷三磷酸(AmP/ATP)的比值的變化。LKB1作為AMPK的上游基因可直接激活AMPK，被激活的AMPK正向調節結節性硬化復合體基因(TSC)，增加TSC1/2復合物表達水平，使mTOR負向調節〔5,6〕。本研究結果表明，AMPK信號通路在老年患者良、惡性胸腔積液中均有表達。本研究結果與該信號通路對原發腫瘤細胞〔7〕代謝的調節相一致。本研究結果也和Matsumto等〔8〕在NSCLC中表明的基因突變研究相一致；另外，在鼠模型研究中，Contreras等〔9,10〕也有相同的結果，本研究結果惡性胸水LKB1蛋白表達的降低可能與之有關；與良性胸水比較，AMPKa與p-AMPKα蛋白表達在惡性胸水中僅有部分樣本有趨勢性改變，這可能與惡性積液中存在某些干擾腫瘤細胞代謝相關的因子有關；王麗紅等〔11〕對子宮內膜癌發病機制中的研究證實，在增殖階段子宮內膜、內膜樣腺癌、內膜非典型增生組織內，AMPK與LKB1表現出較低表達水平，在這兩種基因表達水平而言，相比正常子宮內膜組，子宮內膜樣腺癌組則顯著較低。說明在子宮內膜出現非典型增生與此增生不斷進行最終癌變這一環節， AMPK信號傳導通路的異常發揮起到關鍵作用。目前有關AMPK信號傳導通路在子宮內膜癌、肺小細胞肺癌及喉鱗狀細胞癌等中的研究表明:LKB1與AMPK表達均表現為下降趨勢，這與本研究結果肺腺癌性胸腔積液中的AMPK信號傳導通路變化趨勢相一致。

本研究結果與許晶等〔12〕AMPK信號通路對原發腫瘤細胞代謝調節結果的變化趨勢相一致，雖然該信號通路在相關研究中取得了一些進展和成果，但尚未完全闡明關鍵機制，因此仍需做進一步實驗研究為腫瘤診斷及治療開辟一條新的途徑。