miR-1290靶向STK17A對宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

李園園 王英紅

(石河子大學醫學院第一附屬醫院婦科，新疆 石河子 832000)

宮頸癌是在世界范圍內女性最常見的癌癥之一，也是造成女性腫瘤死亡的主要原因，在大于500 000例宮頸癌患者中，有80%都是在發展中國家，對女性健康造成嚴重威脅〔1，2〕。導致宮頸癌發生的因素包括病毒感染、遺傳因素和環境因素等，目前，手術切除是治療早期宮頸癌的主要手段，放化療也是治療宮頸癌的一種先進方法〔3〕。雖然宮頸癌的診斷和治療策略在不斷發展和進步，但是患者的生存率仍然較低〔4〕。因此，研究宮頸癌發生和發展新的潛在生物學機制是開發創新且有效治療方案的關鍵。微小RNA(miRNA)可通過誘導mRNA分裂和抑制翻譯來介導基因的表達，是腫瘤發生的重要影響因素〔5〕。其中miR-411、miR-198、miR-216、miR-137等已報道與宮頸癌細胞的生物過程密切相關〔6～9〕。miR-1290可通過抑制人LIM同源異性域(LHX)6 mRNA表達促進膠質瘤細胞的增殖和轉移〔10〕。miR-1290通過靶向肌醇多磷酸-4-磷酸酶B(INPP4B)促進結直腸癌細胞增殖，并在mRNA水平上降低p27表達〔11〕。miR-1290通過靶向細胞因子信號通路(SOCS)4促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲〔12〕。因此推測miR-1290可能有原癌基因作用，但miR-1290對于宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響尚未有研究。本研究通過體外細胞實驗，探討抑制miR-1290對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人宮頸癌細胞株HeLa(貨號：TCHu 20)、SiHa(貨號：TCHu 113)和CaSki(貨號：TCHu 137)均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人宮頸上皮永生化細胞H8(貨號：C0397)購自上海冠導生物工程有限公司。

1.1.2主要試劑 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養基購自美國Giboc公司；二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；野生型和突變型STK17A 3′UTR熒光素酶報告基因載體(STK17A WT、STK17A MUT)由上海生工生物有限公司構建；miR-1290陰性對照(miR-1290 NC)、miR-1290抑制劑(miR-1290 inhibitor)、miR-1290模擬物(miR-1290 mimics)及miR-1290、絲氨酸蘇氨酸激酶(STK)17A、β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3實驗儀器 酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；TL988實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自西安天隆科技有限公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測宮頸癌細胞及正常宮頸細胞miR-1290和STK17A表達 將SiHa、HeLa、CaSki、H8細胞接種于含10%FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%的細胞培養箱中。當細胞融合80%以上時，胰蛋白酶消化傳代，取對數期生長狀態良好的細胞，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，用逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增。miR-1290基因上、下游引物分別為5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′和5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGA-3′；STK17A基因上、下游引物分別為：5′-GAACACCATGATCCCTTTGG-3′和5′-GTGCCTTTTCCATCCTGAAA-3′；內參基因β-actin的上、下游引物分別為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′和5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反應體系為2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應條件設定為：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性10 s、60℃退火30 s、40個循環、72 ℃延伸10 min。以β-actin作為內參基因根據2-ΔΔCt算法進行mRNA表達量的計算與分析。取miR-1290相對表達量最高的宮頸癌細胞進行后續實驗。

1.2.2細胞轉染及分組 將Hela癌細胞接種于含10% FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%細胞培養箱中。當細胞融合達80%以上時，胰蛋白酶消化傳代，取對數期生長狀態良好的細胞，將細胞以1×106個/ml密度傳代培養于96孔板中，24 h后取出細胞，根據轉試劑盒說明書用Lipfectamine 2000將miR-1290 NC和miR-1290 inhibitor分別轉染入HeLa細胞。將細胞隨機分為3組：Control組(HeLa細胞未轉染)、miR-1290 NC組(HeLa細胞轉染miR-1290 NC)、miR-1290 inhibitor組(HeLa細胞轉染miR-1290 inhibitor)，轉染或培養48 h后，用于后續實驗。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖率 收集上述1.2.2分組并培養或轉染48 h后的細胞，每組設置6個復孔，每孔加入10 μl MTT繼續孵育4 h，吸取上清，加入150 μl DMSO，充分震蕩混勻15 min后用酶標儀檢測各孔570 nm處OD值。細胞增殖率(%)=(實驗組OD570 nm-空白組OD570 nm)/(對照組OD570 nm-空白組OD570 nm)。

1.2.4檢測細胞遷移和侵襲數 遷移實驗：收集上述1.2.2分組并培養或轉染48 h后的細胞，胰蛋白酶消化，用無血清DMEM/F12培養基吹打成單細胞懸液。將Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用磷酸鹽緩沖液(PBS)提前潤濕5 min，上室加入5×104個細胞，下室加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，然后將Transwell小室置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養6 h，取出聚碳酸酯微孔膜，用中性甲醛固定10 min，結晶紫染色20 min后，顯微鏡下觀察。隨機選取5個100倍不重疊視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數表示細胞遷移能力。實驗重復3次。侵襲實驗：實驗前2 h將Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用基底膠包被，其余步驟同遷移實驗。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗 采用TargetScan在線網站(http：//www.targetscan.org/vert_72/)對miR-1290作用的靶基因進行預測，篩選STK17A作為其可能的靶分子。取對數生長期的HeLa細胞接種于96孔板，常規培養24 h后，將細胞分為miR-1290 mimics+STK17A WT組、miR-1290 NC+STK17A WT組、miR-1290 mimics+STK17A MUT組和miR-1290 NC+STK17A MUT組，每組設3個復孔，進行細胞共轉染。轉染48 h后，應用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測STK17A的熒光強度，具體操作按照試劑盒說明書進行，驗證miR-1290與STK17A的靶向關系。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1宮頸癌細胞與正常宮頸細胞miR-1290和STK17A表達比較 宮頸癌細胞SiHa、HeLa、CaSi的miR-1290表達量顯著高于人正常宮頸上皮細胞H8，STK17A表達量顯著低于人正常宮頸上皮細胞H8(均P<0.05)，且STK17A均得到表達的宮頸癌細胞中以HeLa的miR-1290相對表達量最高。見表1。所以，選擇HeLa細胞進行后續實驗。

2.2抑制miR-1290對HeLa細胞STK17A表達的影響 與Control組(0.15±0.11)和miR-1290 NC組(0.23±0.17)相比，miR-1290 inhibitor組HeLa細胞STK17A mRNA表達水平(10.27±0.96)顯著升高(P<0.05)。

2.3抑制miR-1290對HeLa細胞增殖的影響 與Control組〔(27.35±1.12)%〕和miR-1290 NC組〔(29.77±1.01)%〕相比，miR-1290 inhibitor組〔(10.53±1.28)%〕HeLa細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。

2.4抑制miR-1290對HeLa細胞遷移和侵襲的影響 與Control組和miR-1290 NC組相比，miR-1290 inhibitor組HeLa細胞遷移穿膜細胞數和侵襲穿膜細胞數顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 miR-1290對HeLa細胞遷移和侵襲的 影響個，n=3)

2.5miR-1290與STK17A的靶向關系的預測與驗證 生物信息學預測結果顯示，miR-1290序列上存在STK17A連續的結合位點。見圖1。與miR-1290 NC+STK17A WT組(1.03±0.12)相比，miR-1290 mimics+STK17A WT組(0.47±0.06)STK17A報告基因的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-1290 mimics+STK17A MUT組(0.96±0.09)和miR-1290 NC+STK17A MUT組(0.98±0.10)STK17A報告基因的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

圖1 生物信息學預測miR-1290與 STK17A 3′ UTR結合位點

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統中較為常見的腫瘤，惡性程度極高。癌細胞的遷移和侵襲是導致患者病情惡化，甚至死亡的重要原因〔13〕，miRNAs的異常表達與宮頸癌的發生發展密切相關，miRNAs可通過調控其對應的靶基因表達水平影響癌細胞的生物過程。

miRNA是由長度為18～26個核苷酸構成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，不具備編碼蛋白質的功能，但其表達異常可引起腫瘤等多種疾病的產生〔14〕。miRNA對于宮頸癌的治療和預后都有重大意義，可能參與宮頸癌發生發展的全過程，調節癌細胞的增殖、侵襲、轉移和凋亡。Huang等〔15〕研究發現miR-1290在胃癌患者的細胞系中過表達，可加強胃癌細胞的增殖和侵襲能力，Jin等〔16〕研究發現上調非小細胞肺癌中miR-1290表達可增強細胞增殖、集落形成和侵襲能力。本研究結果提示抑制miR-1290可能抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

miRNA可作為宮頸癌早期診斷和治療的靶標，有創傷小、易獲取和可重復等優點。Liu等〔17〕研究發現miR-1290在結直腸癌和胰腺癌組織中表達異常，可作為結直腸癌和胰腺癌早期診斷的生物標志物。本研究結果提示miR-1290和STK17A之間可能存在靶向關系。STK17A是凋亡相關蛋白(DAP)激酶的家族成員，編碼有蛋白激酶結構的自磷酸化核蛋白，有誘導細胞凋亡的作用，在腫瘤細胞中表達較低〔18〕。作為一種凋亡相關因子，紫外線或某些藥物的刺激可通過STK17A高表達引起細胞凋亡，Xu等〔19〕研究表明過表達STK17A可促進人乳腺癌細胞的凋亡，Gao等〔20〕研究表明卵巢癌細胞中STK17A表達水平的改變導致癌細胞對卡鉑和紫杉醇的易感性發生變化。而miRNA主要通過與靶基因3′ UTR結合而調控細胞生物學功能，為了進一步驗證miR-1290與STK17A的靶向關系，本研究結果提示miR-1290可能通過靶向STK17A進而抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上，miR-1290能通過靶向調控STK17A抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，為宮頸癌的治療提供又一新的靶標，但是STK17A在各種類型的腫瘤細胞表達及其對腫瘤發生和轉移的作用機制較為復雜，尚需進一步研究。