續骨丹對兔脛骨骨折bFGF及TGF-β/BMPs信號通路表達的影響

劉海軍 董萬濤 王前源 黃國源 汪庚申 牛存良 張東亮

(1武威市人民醫院骨二科，甘肅 武威 733000；2甘肅中醫藥大學附屬醫院骨科)

研究顯示中藥在促進骨折愈合方面能夠起到一定的作用〔1,2〕，中藥無論是外敷或是內服均能有效促進骨折的愈合，其中外敷能夠將藥物直接作用于骨質損傷區域，促使藥物能夠快速分散到損傷組織中，同時能夠使得骨折部位肌肉組織收縮，促進骨折愈合。雖研究發現中藥能夠促進骨折愈合，但是對于骨折愈合的機制研究報道較少。本研究所使用的續骨丹屬于中藥外敷方劑，更是非物質文化遺產，已有研究表明其能夠通過調節血管內皮生長因子(VEGF)對骨折愈合產生影響，但對于骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子(TGF)-β、堿性成纖維細胞因子(bFGF)表達研究較少〔3,4〕，本研究旨在探討續骨丹兔脛骨骨折bFGF及TGF-β/BMPs信號通路表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型制作 選取成年新西蘭家兔48只，由動物實驗中心提供，雌雄不限制，體重約3 kg。對74只家兔按隨機抽樣的方式將其分為對照組和觀察組，每組24只。采用3%戊巴比妥鈉對家兔耳緣靜脈注射麻醉，劑量為30 mg/kg。麻醉成功后將家兔俯臥位固定于手術床上，模型制作均選取左后腿，去掉毛后正常消毒鋪單，于左后腿內側做一約3 cm手術切口，剝離肌肉充分暴露左側脛骨中段，使用鋼鋸將脛骨沿中段鋸斷，不做其他任何固定，而后沖洗手術視野，確保無滲血后逐層縫合切口，模式制作完成。術后給予所有大白兔連續3 d肌注青霉素40萬U/d。從術后第1天開始，觀察組給予續骨丹外敷，劑量為150 mg/kg，再用白醋將續骨丹調至糊狀，使用新鮮蔥湯擦洗骨折處后將續骨丹敷于該處，并使用油紙包裹固定，敷藥隔1 d 1次，1次敷藥約3 h；對照組正常喂養不給予其他任何處理。

1.2試劑及儀器 選用北京博奧公司提供的兔BMP、TGF-β、bFGF試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑；選用重慶鼎國公司提供的兔BMP、TGF-β、bFGF酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，其余所有儀器如槍頭、恒溫箱等由神經病理學實驗室提供。

1.3方法 兩組兔子在手術后第1、3、5、7周(每次6只兔子)行X線片檢查骨折處骨痂生長情況及骨折愈合時間。于每個時間點使用ELISA測定兩組血清中BMP、TGF-β、bFGF含量，而后處死兔子后取骨折處標本利用免疫組化法對各時間點的標本進行BMP、TGF-β、bFGF局部組織表達檢測，分析其平均光密度值。

1.4統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1X線片結果 兩組X線片檢查結果顯示：術后1、3 w，兩組骨折處無明顯差異，骨折線均清晰可見；術后5 w，觀察組骨折線模糊，外骨痂已形成并將斷端完全連接，對照組可見有少量骨痂逐漸形成；術后7 w，觀察組骨折已基本愈合，對照組骨折處骨折線模糊，骨髓腔已部分連通，見圖1。

圖1 兩組骨折愈合情況X線片

2.2兩組不同時間點血清BMP、TGF-β、bFGF含量比較 觀察組所有時間點BMP均高于對照組，術后1 w及術后5 w時差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。觀察組所有時間點TGF-β均高于對照組，術后3 w差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。觀察組所有時間點bFGF均高于對照組，術后3 w及術后5 w時差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3兩組不同時間點BMP、TGF-β、bFGF免疫組化表達比較 術后3 w兩組BMP、TGF-β光度值差異有統計學意義(P<0.05)。術后5 w兩組bFGF光度值組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、3，圖2。

表1 兩組不同時間點血清BMP、TGF-β含量比較

表2 兩組不同時間點血清bFGF含量及BMP光度值比較

表3 兩組不同時間點TGF-β、bFGF光度值比較

3 討 論

骨折是臨床中最為常見的疾病之一，骨折快速愈合的關鍵在于骨折斷端的重建和修復，該過程主要依賴于成骨細胞的誘導，在誘導過程中，血管的進一步重建是其前提條件，血管的重建將直接影響到骨折的愈合速度，若骨折斷端血液供應較差，甚至會出現骨不連情況〔5〕。研究〔6，7〕表明，中藥能夠改善骨折斷端處的血液循環，促進成骨細胞的誘導及血管的修復等。中醫認為影響骨折愈合最重要的影響因素為瘀血，在中醫理論中骨折的整個愈合過程主要分為三步，“淤去”“新生”“骨合”，故活血化瘀是治療骨折的關鍵前提。國內外已有學者對于續骨丹進行研究〔8～10〕，結果表明，續骨丹能夠提高骨痂中VEGF表達，從而達到加快骨折斷端血管重生的目的，最終使得骨折愈合的速度加快。隨著研究的不斷深入〔11，12〕。

BMP是骨折愈合過程中骨生成的啟動因子，能夠起到誘導成骨細胞、參與骨生長和修復等重要作用，BMP的主要作用機制在于誘導間充質細胞表面的BMP受體，在外界其他因素的影響下，使間充質細胞轉化為成骨細胞，從而促進骨折斷端的骨細胞生長。同時BMP還能夠在一定程度上抑制破骨細胞的生理功能，使得骨折的愈合加快〔13，14〕。TGF-β的主要作用在于抑制破骨細胞的進一步激活和活化，抑制骨髓腔中間充質細胞向脂肪細胞的轉化，同時TGF-β還能夠促進成骨細胞的活性增加，Ⅰ型膠原和骨橋蛋白合成增加，能夠使骨質積累，促進骨折愈合。bFGF是人體內毛細血管增殖的重要刺激因子，能夠促進骨折斷端處的毛細血管增生，使得骨折斷端處血液供應不斷增加〔14〕。

本研究結果提示，TGF-β與bFGF、BMP存在拮抗作用，而bFGF與BMP則存在一定的協同作用。由此可見，骨折在發生后局部的生理平衡將會被打破，受到刺激的骨折局部將會出現一系列的應激反應，引發3種細胞因子的增加，再通過相關一系列的信號轉導，啟動骨折的修復過程，加速骨折的愈合〔15，16〕。本研究表明續骨丹能夠增加BMP、TGF-β及bFGF的表達，提示其在促進骨折愈合的機制與BMP、TGF-β、bFGF的基因轉錄及翻譯表達有密切相關性。