LncRNA DLX6-AS1靶向miR-374a-3p調控糖尿病患者創面愈合的分子機制

陳嘯 王媛媛 崔云飛 黃賢明

(青島大學附屬青島市海慈醫院血管外科，山東 青島 266000)

創面愈合不良是糖尿病(DM)的常見并發癥，創面愈合受損和反復感染可大大增加下肢截肢風險，甚至導致死亡。研究報道DM和高糖暴露可能導致微血管內皮細胞(HMECs)活力和遷移能力降低，血管生成減少，凋亡增加，從而導致創面愈合緩慢，誘導HMECs增殖和遷移可能是促進創面愈合的潛在方法〔1,2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)通過靶向微小RNA(miRNA)調節下游靶mRNA表達在許多疾病病理過程中發揮作用〔3〕。研究表明LncRNA DLX6-AS1介導糖尿病腎病(DN)腎功能的下降，下調LncRNA DLX6-AS1能夠抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞炎癥反應〔4,5〕。miRNA表達失調與創面愈合不良等多種DM并發癥進展有關〔6〕。研究發現miR-374a-3p低表達介導DN的發生發展〔7〕。骨關節炎(OA)患者軟骨中miR-374a-3p表達降低，過表達miR-374a-3p顯著減輕脂多糖誘導的軟骨細胞損傷〔8〕。靶基因預測顯示miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1的潛在靶點，然而，LncRNA DLX6-AS1是否靶向miR-374a-3p影響創面愈合尚未可知。本研究通過分析糖尿病患者創面組織中LncRNA DLX6-AS1、miR-374a-3p的表達情況，探討LncRNA DLX6-AS1對高糖暴露下人HMECs增殖、遷移和侵襲的影響，并通過miR-374a-3p探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1組織來源 選取青島市海慈醫院DM患者足部潰瘍組織27例標本為DM組，排除下肢動脈疾病、心腦血管疾病或其他并發癥，年齡36～73歲。27例正常人足部組織標本為對照組。兩組年齡、性別差異無統計學意義。本研究經醫院倫理評審委員會批準，參與者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞和試劑 HMECs購自上海研謹生物科技公司；CCK-8試劑盒、Trizol試劑購自南京凱基生物公司；PrimeScript逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連takara生物公司；miRNA檢測試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；si-RNA、miRNA模擬物、miRNA抑制物、pcDNA-RNA、熒光素酶報告載體購自江蘇百奧邁科生物技術有限公司；Cyclin D1兔多克隆抗體(ab226977)、MMP2兔多克隆抗體(ab97779)、MMP9兔多克隆抗體(ab73734)、山羊抗兔二抗(ab205718)、β-actin兔單克隆抗體(ab115777)購自美國Abcam公司；Transwell培養板購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和高糖損傷模型細胞的建立 HMECs接種于含5%胎牛血清、1%內皮生長因子的內皮培養基(ECM)置于37℃、含5%二氧化碳、95%空氣、濕度為70%～80%的培養箱中孵育，在細胞密度達80%～90%即可進行傳代培養。用含30 mmol/L葡萄糖的培養液孵育HMECs 48 h建立高糖損傷細胞模型〔9〕，記為高糖(HG)組。

1.2.2RT-qPCR檢測LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p表達 通過Trizol試劑提取受試者創面組織、的總RNA。用PrimeScript逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行RT-qPCR以檢測LncRNA DLX6-AS1表達。用miRNA檢測試劑盒對miR-374a-3p進行定量檢測。2-ΔΔCt法計算LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p表達量。

1.2.3實驗分組 將HMECs接種24孔板，在細胞密度達50%按照脂質體2000說明書分別將pcDNA、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1、si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1、miR-NC、miR-374a-3p模擬物、anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1、anti-miR-NC +si-LncRNA DLX6-AS1轉染HMECs中，轉染48 h收集細胞備用。正常培養的HMECs為對照(NC)組；高糖損傷細胞模型為HG組；HMECs分別轉染si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1、miR-NC、miR-374a-3p模擬物、anti-miR-374a-3p+ si-LncRNA DLX6-AS1、anti-miR-NC +si-LncRNA DLX6-AS1后進行高糖處理，分別為si-NC+HG組、si-LncRNA DLX6-AS1+HG組、miR-NC+HG組、miR-374a-3p+HG組、anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組、anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組。僅轉染pcDNA、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1、si-NC、si-LncRNA DLX6-AS1的HMECs分別為pcDNA組、pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組、si-NC組、si-LncRNA DLX6-AS1組。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖 將各組HMECs以5×103個/孔接種96孔板，培養48 h后替換為含10% CCK-8試劑的培養基，孵育2 h后，通過酶標儀測定450 nm處光密度(OD)值。細胞增殖率(%)=實驗OD/對照OD×100%

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 將各組HMECs重懸在不含胎牛血清ECM中，取200 μl密度為1×106個/ml細胞懸液接種到上室，將600 μl含20%胎牛血清ECM加入下室。培養箱孵育24 h后，用5%戊二醛固定穿膜細胞，0.1%結晶紫染色。以顯微鏡下隨機選取5個視野細胞數均值表示HMECs遷移數量。侵襲檢測采用包被基質膠的上室，其他步驟參考遷移檢測。

1.2.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白水平 向各組HMECs中加入細胞裂解緩沖液4℃孵育15 min，離心收集上清即為蛋白樣品。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后進行濕法轉膜，封閉膜后，在4℃下用一抗孵育10 h。隨后與二抗在室溫下孵育1 h，滴加顯影液顯影，以Image J軟件測得的靶蛋白和內參β-actin灰度值比值表示靶蛋白表達量。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 starBase數據庫預測顯示LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p序列之間存在特異性結合區。構建野生型(WT)報告載體LncRNA DLX6-AS1-WT和突變型(MUT)報告載體LncRNA DLX6-AS1-MUT。將報告載體分別與miR-374a-3p模擬物、miR-NC共轉染到HMECs中，轉染48 h后，收獲細胞、裂解細胞，離心收集上清，測量相對熒光素酶活性。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1DM組和對照組創面組織中LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p和表達情況 與對照組比較，DM組創面組織中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2高糖處理HMECs細胞模型中miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1表達情況 與NC組比較，HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表1 兩組創面組織中miR-374a-3p和 LncRNA DLX6-AS1表達情況

表2 高糖處理HMECs的細胞模型中miR-374a-3p和 LncRNA DLX6-AS1表達情況

2.3下調LncRNA DLX6-AS1對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與NC組比較，HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量顯著降低(P<0.05)；與si-NC+HG組比較，si-LncRNA DLX6-AS1+HG組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量顯著升高(P<0.05)，見圖1和表3。

1～4：NC組，HG組，si-NC+HG組，si-LncRNA DLX6-AS1+HG組圖1 Western印跡檢測CyclinD1、MMP-2和 MMP-9的蛋白表達

表3 下調LncRNA DLX6-AS1對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

2.4上調miR-374a-3p對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC+HG組比較，miR-374a-3p+HG組HMECs中miR-374a-3p表達水平、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量顯著升高(P<0.05)，見表4和圖2。

表4 上調miR-374a-3p對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

1，2：miR-NC+HG組，miR-374a-3p+HG組圖2 Western印跡檢測CyclinD1、MMP-2和 MMP-9蛋白的表達

2.5LncRNA DLX6-AS1靶向調控miR-374a-3p的表達 starbase預測到miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1存在特異性結合位點，見圖3。同與LncRNA DLX6-AS1-WT共轉染時，與轉染miR-NC比較，轉染miR-374a-3p模擬物可降低HMECs相對熒光素酶活性(P<0.05)，見表5。與pcDNA組比較，pcDNA-LncRNA DLX6-AS1組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-374a-3p表達水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-LncRNA DLX6-AS1組HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-374a-3p表達水平顯著升高(P<0.05)，見表6。

圖3 starbase對miR-374a-3p和LncRNA DLX6-AS1結合進行預測示意圖

2.6下調miR-374a-3p可以逆轉LncRNA DLX6-AS1低表達對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組比較，anti-miR-374a-3p+ si-LncRNA DLX6-AS1+HG組HMECs中miR-374a-3p表達水平、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞增殖率、遷移數量、侵襲數量顯著降低(P<0.05)，見圖4和表7。

表5 相對熒光素酶活性檢測

表6 RT-qPCR檢測LncRNA DLX6-AS1和 miR-374a-3p的表達

1，2：anti-miR-NC+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組，anti-miR-374a-3p+si-LncRNA DLX6-AS1+HG組圖4 Western印跡檢測CyclinD1、 MMP-2和MMP-9蛋白表達

表7 下調miR-374a-3p可以逆轉LncRNA DLX6-AS1低表達對高糖處理的HMECs增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

盡管已有抗生素治療、清創、高壓氧治療、控制血糖等促進創面愈合方法，但在臨床上仍有多數DM患者因創面愈合不良最終不得不選擇截肢。研究發現DM創面中存在大量差異表達的非編碼RNA(ncRNA)。LncRNA GAS5在DM足部潰瘍患者皮膚組織中表達下調，上調LncRNA GAS5促進高糖處理的內皮細胞增殖和管形成，加速創面愈合〔10〕。LncRNA MALAT1通過激活HIF-1α信號通路促進DM小鼠成纖維細胞的活化和創面膠原表達〔11〕。miR-296-5p可提高DM創面的愈合率〔12〕。因此，ncRNA可能是促進DM創面愈合的有效分子工具。本研究檢測到DM患者創面組織、高糖處理的HMECs中LncRNA DLX6-AS1表達顯著升高，miR-374a-3p表達顯著降低，提示LncRNA DLX6-AS1和miR-374a-3p異常表達可能是DM患者創面愈合不良的原因之一。功能實驗表明，高糖處理可抑制HMECs增殖、遷移和侵襲，下調CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平，表明高糖通過抑制HMECs生物活性來阻止創面愈合。研究表明LncRNA DLX6-AS1通過多種機制參與細胞生物活性的調控。例如，在急性腎損傷中敲低LncRNA DLX6-AS1可抑制脂多糖誘導的腎小管上皮細胞毒性和細胞焦亡〔13〕。LncRNA DLX6-AS1通過靶向參與缺氧復氧誘導的神經元凋亡〔14〕。此外，下調lncRNA SNHG5可通過調控miR-374a-3p來緩解膿毒癥誘導的急性腎損傷〔15〕。本研究發現下調LncRNA DLX6-AS1或上調miR-374a-3p表達均能夠促進HMECs增殖、遷移和侵襲，表明下調LncRNA DLX6-AS1或上調miR-374a-3p可能通過增加HMECs增殖、遷移和侵襲能力來促進創面愈合。

LncRNA可作為miRNA的分子海綿參與DM創面愈合進展〔16,17〕。本研究證實miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1的直接靶基因，且miR-374a-3p表達受到LncRNA DLX6-AS1負性調控。下調LncRNA DLX6-AS1與上調miR-374a-3p對CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達及HMECs增殖、遷移、侵襲的影響相吻合，且下調miR-374a-3p顯著減弱LncRNA DLX6-AS1低表達對HMECs生物學功能和CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響，表明靶向miR-374a-3p是LncRNA DLX6-AS1調控HMECs增殖、遷移和侵襲的重要機制。

綜上，DM患者創面組織中LncRNA DLX6-AS1表達增加，miR-374a-3p表達減少。下調LncRNA DLX6-AS1通過促進miR-374a-3p表達可誘導HMECs增殖、遷移和侵襲。因此，靶向抑制LncRNA DLX6-AS1/miR-374a-3p途徑可能是促進DM患者創面愈合的重要策略。