miR-126-3p靶向AKT2對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響

王玉風 喬建治 梁莉

(南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院眼科，河南 南陽 473000)

葡萄膜黑色素瘤是眼部疾病中常見的原發性惡性腫瘤，其具高發病率與高死亡率的特點，臨床采用手術摘除眼球的方法進行治療，但患者預后較差〔1，2〕。微小RNA(miRNA)屬于非編碼單鏈RNA，在葡萄膜黑色素瘤中一些miRNA發揮抑癌或促癌作用，對腫瘤細胞增殖、遷移等有影響〔3，4〕。微小RNA-126-3p(miR-126-3p)在梭形細胞型與上皮細胞型葡萄膜黑色素瘤組織中表達下調，但關于其具體作用機制尚未可知〔5〕。靶基因網站TargetScan預測顯示絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)2可能是miR-126-3p的靶基因，研究表明AKT2在胃癌組織中的表達水平升高〔6，7〕。但miR-126-3p與AKT2在葡萄膜黑色素瘤中的調控機制尚未可知。本研究主要探討miR-126-3p可能通過靶向AKT2影響葡萄膜黑色素瘤細胞的生物學行為。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 葡萄膜黑色素瘤細胞MUM2B購自美國ATCC公司；miR-126-3p、miR-NC、si-AKT2、si-NC均購自廣州銳博；山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷；miR-126-3p及anti-miR-NC購自上海吉瑪；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗人AKT2、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、P21、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)購自美國Santa Cruz公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質膠購自美國BD公司；反轉錄試劑盒與SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；MTT購自美國Sigma公司；Trizol試劑、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

組織標本來源：收集南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院2016年8月至2018年5月24例確診原發性人葡萄膜黑色素瘤患者，男15例，女9例，年齡為30～65歲，平均年齡為(48.57±6.57)歲；同時取同期醫院收治的因外傷需摘除眼球的患者15例為對照，受試人員眼部組織均為正常葡萄膜組織，其中男8例，女7例，平均年齡為(50.42±7.73)歲，年齡為32～65歲。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組 將對數期MUM2B細胞接種于6孔板，分為miR-NC組(轉染miR-NC)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、miR-126-3p組(轉染miR-126-3p mimics)、anti-miR-126-3p組(轉染anti-miR-126-3p)、si-NC組(轉染si-NC)、si-AKT2組(轉染si-AKT2)、miR-126-3p+pcDNA3.1組(共轉染miR-126-3p mimics與pcDNA3.1)、miR-126-3p+pcDNA3.1-AKT2組(共轉染miR-126-3p mimics與pcDNA3.1-AKT2)，繼續培養48 h，收集細胞。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-126-3p的表達水平 用Trizol法提取組織及MUM2B細胞中總RNA，反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增反應。miR-126-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126-3p相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 各組MUM2B細胞接種96孔板，加MTT溶液20 μl/孔，繼續培養4 h，孔內加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀檢測各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.4平板克隆形成實驗 取對數生長期MUM2B細胞接種于48孔板，按照“1.2.1”分組，每組設置3個復孔，各組轉染48 h時，棄舊培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，依次加入消化液與培養液制備細胞懸液(3×104個/ml)，取細胞懸液接種于12孔板(100個/孔)，每3 d更換一次培養液，觀察克隆細胞形成數。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 侵襲實驗：用預冷培養液(8∶1比例)稀釋基質膠，取在Transwell上室加40 μl稀釋液，下室加含血清培養液600 μl，培養24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察侵襲細胞數。遷移實驗：Transwell上室內不加基質膠，后續實驗步驟同侵襲實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測 TargetScan預測AKT2與miR-126-3p存在互補序列，將AKT2-3′UTR插入熒光素酶報告基因載體，構建野生型報告質粒WT-AKT2、突變型報告質粒MUT-AKT2。取生長期MUM2B細胞，將MUT-AKT2、WT-AKT2與miR-NC或miR-126-3p共轉染。轉染24 h，檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測AKT2、CyclinD1、MMP-2、P21、E-cadherin蛋白表達 加入RIPA裂解液到細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度用BCA法，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，轉膜，封閉，加一抗稀釋液AKT2(1∶800)、CyclinD1(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、P21(1∶1 000)、E-cadherin(1∶800)，4℃孵育24 h，二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，加電化學發光(ECL)顯影。應用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1正常葡萄膜組織和葡萄膜黑色素瘤組織中miR-126-3p表達 與正常葡萄膜組織比較，葡萄膜黑色素瘤組織中miR-126-3p表達顯著降低(1.01±0.10 vs 0.20±0.02，t=38.754，P<0.001)。

2.2過表達miR-126-3p對MUM2B細胞增殖、遷移及侵襲的影響 miR-126-3p組細胞存活、克隆數、遷移、侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2蛋白表達明顯低于miR-NC組(P<0.05)，P21、E-cadherin蛋白表達均明顯高于miR-NC組(P<0.05)，見圖1～3、表1。

圖1 過表達miR-126-3p對MUM2B細胞克隆形成的影響

圖2 過表達miR-126-3p對MUM2B細胞遷移、 侵襲的影響(×200，結晶紫染色)

圖3 過表達miR-126-3p對MUM2B細胞增殖、 遷移、侵襲蛋白表達的影響

表1 過表達miR-126-3p對細胞MUM2B增殖、遷移、侵襲的影響

2.3miR-126-3p靶向、調控AKT2 TargetScan預測顯示AKT2的3′UTR含有miR-126-3p的互補序列，見圖4A。與miR-NC組相比，miR-126-3p組WT-AKT2熒光素酶活性顯著降低，見表2。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-126-3p組AKT2蛋白表達顯著升高(0.65±0.06 vs 1.07±0.11，P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-126-3p組AKT2蛋白表達顯著降低(0.66±0.07 vs 0.23±0.02，P<0.05)，見圖4B。

A：AKT2與miR-126-3p的互補序列；B：miR-126-3p調控AKT2的表達；1～4：miR-NC組，miR-126-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-126-3p組圖4 miR-126-3p靶向調控AKT2

2.4抑制AKT2對MUM2B細胞增殖、遷移、侵襲的影響 si-AKT2組細胞存活率、克隆數、遷移、侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2蛋白表達明顯低于si-NC組(P<0.05)，P21、E-cadherin蛋白表達明顯高于si-NC組(P<0.05)，圖5、表3。

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖5 抑制AKT2對MUM2B細胞增殖、遷移、 侵襲蛋白表達的影響

2.5過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對MUM2B細胞增殖的影響 miR-126-3p+pcDNA3.1-AKT2組中AKT2蛋白表達、細胞存活率、克隆數、CyclinD1蛋白表達明顯高于miR-126-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)，P21蛋白表達明顯低于miR-126-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)，表4、圖6。

表3 抑制AKT2對MUM2B細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.6過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對MUM2B細胞遷移、侵襲的影響 miR-126-3p+pcDNA3.1-AKT2組遷移、侵襲細胞數、MMP-2蛋白表達明顯高于(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達明顯低于miR-126-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)，圖7、表5。

表4 過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對細胞MUM2B增殖的影響

1～4:miR-NC組，miR-126-3p組，miR-126-3p+pcDNA3.1組，miR-126-3p+pcDNA3.1-AKT2組圖6 過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對 MUM2B細胞增殖蛋白表達的影響

1～4：miR-NC組，miR-126-3p組，miR-126-3p+pcDNA3.1組，miR-126-3p+pcDNA3.1-AKT2組圖7 過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對細胞 MUM2B遷移、侵襲蛋白表達的影響

表5 過表達AKT2能逆轉miR-126-3p對MUM2B細胞遷移、侵襲的影響

3 討 論

研究表明，在甲狀腺癌組織及細胞中miR-126-3p表達被下調，miR-126-3p上調對甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲有明顯抑制，凋亡則明顯促進〔8〕。miR-126-3p通過靶向PLXNB2而抑制卵巢癌細胞增殖及侵襲〔9〕。miR-126-3p通過靶向CCR1抑制非小細胞肺癌的生長、遷移及侵襲〔10〕。相關報道指出miR-126-3p可抑制甲狀腺癌細胞生長和轉移〔11〕。本研究發現，在葡萄膜黑色素瘤組織中miR-126-3p表達下調，過表達miR-126-3p可降低葡萄膜黑色素瘤細胞存活率、遷移及侵襲細胞數，提示miR-126-3p可抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移及侵襲。CyclinD1通過細胞周期依賴蛋白激酶結合，促進細胞周期在G1期停滯，從而抑制細胞生長〔12，13〕。MMP-2一方面促進腫瘤細胞轉移，另一方面還能降解細胞外基質；E-cadherin下調能增強上皮-間質轉化從而促進細胞轉移能力〔14〕。本研究發現，miR-126-3p過表達下調葡萄膜黑色素瘤細胞中CyclinD1、MMP-2蛋白表達，上調P21、E-cadherin蛋白表達水平，提示miR-126-3p可能通過上調P21、E-cadherin及下調CyclinD1、MMP-2從而降低葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力。

AKT2在胃癌細胞中的表達上調，研究表明miR-98-5p可通過下調AKT2表達而抑制胃癌細胞增殖〔15〕。miR-296還能通過靶向AKT2而抑制胰腺癌細胞增殖〔16〕。相關報道指出miR-503在宮頸癌中表達下調，并通過靶向抑制AKT2表達而抑制腫瘤的生長〔17〕。提示AKT2在腫瘤中可能發揮癌基因作用。本研究顯示，抑制AKT2可抑制細胞增殖、遷移及侵襲。miR-126-3p可負向調控AKT2表達，進一步實驗顯示，miR-126-3p過表達可通過下調AKT2抑制葡萄膜黑色素瘤細胞惡性生物學行為。

綜上，過表達miR-126-3p抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移及侵襲，可能與抑制靶基因AKT2的表達有關，為探究葡萄膜黑色素瘤發病的分子機制奠定理論基礎。但本研究存在不足之處，本研究僅采用一種葡萄膜黑色素瘤細胞株進行研究，關于其在葡萄膜黑色素瘤其他細胞株中的研究尚未可知，同時本研究結果仍需進行體內實驗進一步驗證。