蘆薈苷通過調控PI3K/AKT信號通路抑制膀胱癌細胞T24增殖、促進細胞凋亡

陳瑞廷 趙俊峰 董建設 孫繼建 張林超 王國橋 楊錦建 賈占奎

(1河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院) 泌尿外科，河南 鄭州 450002；2鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科)

膀胱癌是泌尿系統最常見的腫瘤，具有高復發率和高死亡率的特點〔1〕；中藥因其取材廣，毒副作用小等優點可用于膀胱癌的治療〔2〕。蘆薈苷是從蘆薈的主要活性成分之一，研究顯示蘆薈苷具有抗癌作用，蘆薈苷可抑制食管癌細胞系KESY70的增殖和侵襲，促進細胞凋亡〔3〕。蘆薈苷可以抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，同時可以抑制體外成瘤能力〔4〕。蘆薈苷可抑制胃癌細胞的增殖和遷移〔5〕。蘆薈苷可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑抑制肝細胞癌的生長和侵襲并誘導其凋亡和自噬，從而增強抗腫瘤作用〔6〕。但蘆薈苷對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響及機制尚不清楚。研究報道黃芩素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯及凋亡〔7〕。蟲草素通過抑制PI3K/AKT信號通路誘導人膀胱癌T24細胞凋亡〔8〕。本實驗旨在研究蘆薈苷對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響及機制是否與PI3K/AKT信號通路有關。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌細胞T24購自美國ATCC；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；蘆薈苷(純度≥98%)、順鉑(純度≥98.5%)購自上海恒斐生物科技有限公司；PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002購自上海源葉生物科技有限公司；AKT激活劑胰島素樣生長因子(IGF)-Ⅰ購自北京博奧森生物技術有限公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8、凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司；一抗及山羊抗兔IgG-HRP購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2細胞處理與分組 膀胱癌細胞T24用RPMI1640培養液常規培養，分別用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L蘆薈苷處理T24細胞，作為不同濃度蘆薈苷組，其中用200 μmol/L蘆薈苷處理的T24細胞，記為蘆薈苷組，10 μmol/L順鉑處理的T24細胞記為順鉑組，不做任何處理的T24細胞作為空白組。

用50 μmol/L LY294002和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細胞，記為蘆薈苷+AKT抑制劑組；用100 ng/ml IGF-Ⅰ和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細胞，記為蘆薈苷+AKT激活劑組；用等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細胞為對照，記為蘆薈苷+PBS組。

1.3CCK-8檢測細胞增殖存活率 各組細胞培養24、48、72 h時，按試劑盒說明操作，每孔加入10 μl CCK-8試劑，最后用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度值(A)。計算細胞增殖存活率(%)。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期 收集各組細胞，用預冷的70%乙醇固定，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃水浴30 min，加入400 μl碘化丙啶(PI)后4℃避光30 min，上機流式細胞儀檢測，同時用DNA細胞周期分析軟件進行檢測分析。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，漂洗，分別加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測。

1.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B細胞淋巴瘤(Bcl)-xL、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3、Cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 提取各組細胞的總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜上，封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影、成像，分析蛋白條帶灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度的蘆薈苷對膀胱癌細胞存活的影響 與空白組相比，不同濃度蘆薈苷處理膀胱癌細胞48 h及72 h后細胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，濃度25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的蘆薈苷在處理膀胱癌細胞24 h時細胞增殖存活率也顯著降低(P<0.05)；順鉑組24 h、48 h及72 h細胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，見表1。后續試驗選用200 μmol/L蘆薈苷。

表1 不同濃度蘆薈苷對膀胱癌細胞增殖存活率的影響

2.2蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞存活的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組24、48、72 h細胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組24、48、72 h細胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組24、48、72 h細胞增殖存活率顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組對膀胱癌細胞增殖、細胞周期、蛋白表達的影響

2.3蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞周期的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(均P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低，蘆薈苷+AKT激活劑組G0-G1期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高(均P<0.05)，見表2。

2.4蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞周期蛋白表達的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組CyclinD1蛋白表達水平顯著降低，P21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組CyclinD1蛋白表達水平顯著降低，P21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組CyclinD1蛋白表達水平顯著升高，P21蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見表2、圖1。

2.5蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞凋亡的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖2，表3。

1～6:空白組，蘆薈苷組，蘆薈苷+PBS組，蘆薈苷+AKT抑制劑組，蘆薈苷+AKT激活劑組，順鉑組，圖3同圖1 Western印跡檢測膀胱癌細胞周期蛋白CyclinD1和 p21蛋白表達

圖2 流式細胞術檢測膀胱癌細胞凋亡

2.6蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞凋亡蛋白表達的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組Bcl-xL蛋白表達水平顯著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組Bcl-xL蛋白表達水平顯著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組Bcl-xL蛋白表達水平顯著升高，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見表3，圖3。

2.7蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對膀胱癌細胞PI3K/AKT信號通路蛋白表達的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；而各組PI3K、AKT蛋白水平無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組對膀胱癌細胞凋亡蛋白表達、PI3K/AKT信號通路、細胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測膀胱癌細胞凋亡蛋白Bcl-xL、 Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達

3 討 論

細胞增殖和凋亡失衡可導致腫瘤的發生，近年來研究表明中藥及其天然藥物活性成分具有抗腫瘤作用〔9,10〕。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療的研究熱點。研究報道蘆薈苷通過靶向高遷移率族框(HMGB)1抑制AKT-mTOR-P70S6K和細胞外信號調節激酶(ERK)-cAMP調節元件結合(CREB)信號通路激活可誘導胃癌細胞凋亡〔11〕。蘆薈苷通過激活p38和c-Jun NH2-末端激酶(JNK)信號通路并抑制ERK信號通路在體外誘導人胃癌細胞凋亡〔12〕。蘆薈苷可能通過ROS-促分裂原激活的蛋白激酶(MEK)信號傳導途徑和p53磷酸化誘導肺癌A549細胞凋亡〔13〕。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，下調其表達可促進細胞凋亡〔14〕。本實驗結果說明蘆薈苷可抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞周期停滯和凋亡。

惡性腫瘤的發生發展是多種信號傳導通路共同作用的結果，PI3K/AKT信號通路的異常活化參與多種腫瘤細胞存活、增殖、侵襲的等發生發展過程〔15〕。隱丹參酮通過抑制PTEN/PI3K/AKT途徑抑制膀胱癌細胞增殖并促進細胞凋亡〔16〕。冬凌草甲素可通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制前列腺癌細胞增殖，誘導G2/M細胞周期停滯和凋亡〔17〕。蝙蝠葛堿通過抑制腎癌細胞中的PI3K/AKT信號傳導途徑抑制細胞活力并誘導細胞周期停滯和凋亡〔18〕。本實驗結果表明蘆薈苷可能抑制PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002可增強蘆薈苷對膀胱癌細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。而PI3K/AKT信號通路IGF-Ⅰ逆轉了蘆薈苷對膀胱癌細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

綜上，蘆薈苷可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制膀胱癌細胞T24增殖、促進細胞凋亡。