如意金黃貼對良性前列腺增生大鼠TGFβ1、PTGS2 mRNA及相關蛋白的影響

池寧娟 劉明義 馮娟 石小鵬 王婧雯

(空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，陜西 西安 710032)

良性前列腺增生(BPH)是引起中老年男性排尿障礙最常見的一種良性疾病，其發病率隨著年齡而增加〔1〕。BPH在中醫上屬于“癃閉”“淋證”的范疇，其主要的病機是濕熱蘊結、氣滯血瘀、脾腎氣虛等〔2〕。如意金黃貼(RYT)是本研究依據《中國藥典》2015版一部如意金黃散制成的外用貼劑，具有清熱解毒，消腫止痛的功效，在臨床上用于治療BPH有較好的療效，但其作用機制并不清楚〔3,4〕。本實驗探討RYT對BPH大鼠前列腺指數的影響及其可能的作用機制，以期為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雄性大鼠，體重180～200 g，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，醫動證字SCXK(軍)2016-0007，動物使用許可證號：SYXK(軍) 2016-0023。大鼠均在溫度(25±2)℃、相對濕度45%～65%、光照12 h的清潔環境中飼養1 w后實驗，飼養期間大鼠自由進食、飲水。

1.2實驗藥物和試劑 RYT RYT由醫院藥劑科制(批號：20161201)，每貼面積為18.84 cm2，重量2.9 g，每克相當于表面積6.50 cm2，含生藥0.674 g/cm2；丙酸睪酮注射液，上海通用藥業股份有限公司(批號：160702)，規格：25 mg/ml；保列治(Finasteride)：杭州默沙東制藥有限公司(批號：R009405；規格：5 mg/片)。轉化生長因子(TGF)β1和前列腺素內過氧化物合成酶(PTGS)2引物購于TakaRa公司。兔抗-Ⅰ型前膠原蛋白(Pro-COL-Ⅰ)、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)、血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞外調節蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、原癌基因c-Jun、c-Fos、山羊抗小鼠、兔IgG標記的辣根過氧化物酶(HRP)抗體均購自 Santa Cruz 公司。RAPI組織細胞裂解液購自上海碧云天公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、HRP化學發光底物購于Millipore公司。iQTM5多重實時熒光定量PCR儀，設備編號：582BR016236，購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀，設備編號：N05C023603，購自德國貝克曼公司；電泳儀，設備編號：N10B014643，購自美國Bio-Rad公司。

1.3實驗流程

1.3.1動物分組 取潔凈級雄性SD大鼠40只，隨機分為5組，即對照組、模型組、保列治組、RYT高劑量組、RYT低劑量組，每組8只。

1.3.2模型建立與給藥方法 對照組注射生理鹽水0.5 ml/kg，其余各組大鼠皮下注射丙酸睪酮10 mg/kg，每天1次，連續30 d。于造模第1天起給予藥物干預，保列治組灌胃給藥保列治(4.5 mg/kg)，RYT高、低劑量組背部脫毛區分別貼42.0 cm2/kg、21.0 cm2/kg的藥物，對照組和模型組的大鼠背部脫毛區均貼基質貼，每天給藥1次，連續30 d。

1.3.3標本采集 末次用藥后大鼠禁食12 h，稱體重，處死大鼠，取前列腺隨即稱重，計算前列腺指數(臟器重量/體重×1 000)。取前列腺組織腹葉2份，液氮凍存，一份RT-PCR測定前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA表達，另一份Western印跡測定前列腺組織中有關蛋白的表達。

1.3.4RT-PCR分析前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA表達 按照TaKaRa公司的說明書操作提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA的含量及純度，經測定A260/A280比值在1.8～2.0之間,進行cDNA模板合成。引物設計根據目的基因Genbank中的已知序列，由TakaRa設計并合成，GAPDH為內參。逆轉錄PCR嚴格按照試劑盒說明進行，iQTM5多重實時熒光定量PCR儀定量分析。RT-PCR引物合成序列：TGFβ1上游引物：5′-TCAGTGCCACATACCAACTGGAG-3′，下游：5′-GTGCCAACCGGTACCTTGCTA-3′(150 bp)；PTGS2上游引物：5′-GCGACTGTTCCAAACCAGCA-3′，下游：5′-TGGGT-CGAACTTGAGTTTGAAGTG-3′(112 bp)；GAPDH上游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，下游：5′-GGCACGTCAAGGCTGAGAATG-3′(143 bp)。

1.3.5Western印跡檢測前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達 取凍存于液氮的前列腺組織，每組取樣品2塊置于冰浴玻璃研磨器中，加入1 ml組織裂解液，反復研磨使組織沉淀均勻地溶散在裂解液中，冰浴上裂解30 min，每隔10 min振搖1次。4℃ 12 000 r/min離心20 min，上清液即為組織蛋白提取液。BCA 法測定蛋白含量，總蛋白樣品加入等體積變性液煮沸10 min。調整上樣量為25 μg 蛋白/泳道，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳(SDS-PAGE)，半干轉膜、封閉，分別與抗Pro-COL-1(1∶500)、COL-1(1∶500)、VCAM-1(1∶500)、ERK(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、c-Jun(1∶400)、c-Fos(1∶500)一抗反應，4℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗(1∶3 000 ～ 1∶5 000)，37℃孵育 50～70 min，化學發光、顯影、壓片，以β肌動蛋白為內參，采用圖像分析軟件計算相對表達量。

1.4統計學分析 采用 SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、Games-Howell檢驗。

2 結 果

2.1RYT對BPH大鼠前列腺指數的影響 與對照組比較，模型組前列腺指數增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，保列治組、RYT高、低劑量組大鼠前列腺指數降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2RYT對BPH大鼠前列腺組織中TGFβ1、PTGS2 mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組前列腺組織中TGFβ1、PTGS2 mRNA表達顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，保列治組和RYT高、低劑量組TGFβ1、PTGS2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組前列腺指數及前列腺組織中TGFβ1、 PTGS2 mRNA的表達

2.3RYT對BPH大鼠前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組Pro-COL-1表達增加(P<0.05)，VCAM-1表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而COL-1表達增加不顯著(P>0.05)。與模型組比較，RYT高劑量組COL-1下降、VCAM-1表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；RYT低劑量組Pro-COL-1表達下降、VCAM-1表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4RYT對BPH大鼠前列腺組織中ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組p-ERK表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，c-Fos表達增加(P<0.05)。與模型組比較，保列治組和RYT高劑量組c-Fos表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，RYT低劑量組p-ERK表達增加(P<0.05)、c-Fos表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達

3 討 論

BPH俗稱“前列腺肥大”，是一種緩慢進展性、以下尿路癥狀為主的疾病，是老年男性的常見病，隨著年齡增加，患病率顯著增高。目前BPH治療方法主要是外科治療和藥物治療，外科治療效果較好，但大多數患者為中、老年人，基礎疾病復雜，不適宜外科手術治療或不愿意接受手術治療；而藥物治療主要包括化學藥物、中藥及中藥制劑治療，化學藥物有較多不良反應，因此，從中藥或中藥制劑中尋找安全、有效的治療方法就顯得尤為必要〔5～8〕。中醫學認為濕熱蘊結、氣滯血瘀、腎陽虧虛、腎陰不足、脾腎氣虛等因素為BPH的主要病機，因此清濕熱、散淤結、利氣機、化瘀血、扶元補虛為其治療的原則〔2〕。如意金黃散是出自明代陳實功的《外科正宗》卷之一，收錄在《中國藥典》(2015 年版)的制劑，處方由姜黃、大黃、黃柏、蒼術、厚樸、陳皮、甘草、生天南星、白芷和天花粉 10 味中藥組成，具有清熱燥濕、行氣、散瘀、利水消腫的功效〔9〕。RYT是本單位依據如意金黃散制成的外用貼劑，在臨床上用于治療BPH，且療效顯著。RYT給藥部位為會陰穴，該穴位主治疾病有小便不利、遺尿、遺精、勃起功能障礙等。本實驗結果提示一定劑量的丙酸睪酮可致大鼠BPH，而RYT可有效抑制由丙酸睪酮所致大鼠BPH所引起的泌尿器官重量的指數。

目前研究認為生長因子、炎癥反應、生殖激素水平紊亂、前列腺間質和上皮細胞相互作用等因素與BPH的發生密切相關〔10～12〕。TGFβ1是一種多肽類細胞生長因子，具有雙向調節細胞凋亡、分化和增殖等多種生物活性，前列腺發育的微環境穩態主要是由促有絲分裂因子的刺激作用和 TGFβ1 的抑制作用的平衡來調節，在老年BPH患者血清中 TGFβ1 水平升高〔13〕。PTGS2為一種誘導性即刻反應基因，正常生理狀況下，在大多數組織細胞不表達，但在炎癥等病理反應過程中，受炎癥介質、生長因子、細胞因子、促癌因子、缺氧、激素等刺激因素作用，其表達迅速上調，PTGS2主要產物前列腺素具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、抑制免疫監視、促進血管生成等生物活性〔14〕。本實驗結果顯示，BPH大鼠前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA水平顯著上升，而RYT可顯著降低TGFβ1和PTGS2 mRNA水平。

前列腺間質與上皮細胞增殖和凋亡的平衡性破壞被認為是BPH發生和發展的生物學基礎，而膠原蛋白(COL)是各組織中的重要成分并構成組織細胞外基質，COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ水平的異常會引起組織的增生〔15〕。本研究結果提示BPH大鼠前列腺組織中COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ增加，使用RYT可降低COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ表達水平。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員之一，能介導細胞黏附和信號轉導〔16〕，ERK是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵，它的信號傳遞途徑是涉及調節細胞生長、發育及分裂的信號網絡的核心，p-ERK由胞質轉位到核內，進而介導Elk-1、ATF、Ap-1、c-Jun和c-fos的轉錄活化，參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的癌變等多種生物學反應〔17〕。本研究結果提示BPH大鼠前列腺組織中VCAM-1、ERK、p-ERK表達降低、c-Jun和c-fos表達增加，使用RYT可增加VCAM-1、ERK、p-ERK表達、降低c-Jun和c-fos表達。

該藥前期研究〔4〕表明其可降低BPH大鼠前列腺上皮細胞增生及平滑肌增厚，減輕間質纖維細胞增生，對MAPK信號通路的分子有調節作用。本研究RYT可能通過降低TGFβ1、Ptgs-2 mRNA和Pro-COL-1及c-Fos表達，增加VCAM-1和p-ERK表達而抑制大鼠BPH。本研究通過探討RYT在BPH中的作用及其機制，為BPH的防治提供了新的思路和方法，也為RYT的臨床應用提供了分子機制依據。