Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病性關節炎發病中的作用

劉冬戀 張雨晴 楊婷 何欣宇 王玉江

(成都醫學院四川養老與老年健康協同創新中心，四川 成都 610500)

骨性關節炎(OA)是一種因關節軟骨退變、破壞所導致的關節疼痛，以不同程度的活動受限、軟骨下骨質硬化、關節周圍骨贅形成等為主要表現的關節退行性疾患。由于該疾患病程長且不能根治，病變將隨著時間的延長不斷破壞關節軟骨、滑膜，侵犯軟骨下骨質及關節周圍肌肉等組織，最終造成關節疼痛癥狀加重甚至關節生理功能喪失，極大地增加了老年人病殘率，對病患的身體健康及生活質量帶來嚴重的影響。對糖尿病患者來說，長期暴露在糖尿病環境中，通過分子和結構水平上的各種機制，會導致骨代謝的改變和骨微結構的受損〔1〕。同時患有OA和糖尿病的人群中，與OA相關的步行困難是糖尿病并發癥如高血糖、感染、視網膜病變等出現的一個重要的潛在危險因素。OA患者有限的活動性和避免高強度、高沖擊性下肢運動可能會阻止患者遵循健康的活動/運動方案，從而導致血糖控制惡化〔2〕。膝關節OA+糖尿病患者患單側和雙側膝關節疼痛的可能性分別是膝關節OA+非DM患者的2.45和2.55倍〔3〕。這些研究告訴我們，糖尿病與OA是密切相連的，糖尿病性關節炎是機體功能紊亂的表現，也是糖尿病的并發癥之一。

Wnt/β-catenin信號通路主要分為經典信號通路和非經典信號通路，前者是研究的最為廣泛的信號通路，控制著不同的生物過程，包括胚胎發育、細胞周期進程、糖原代謝和免疫調節，與癌癥、2型糖尿病(T2DM)、炎癥、OA和帕金森癥等疾病的發生發展密切相關。本文以經典的Wnt/β-catenin信號通路作為研究對象，研究Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病性關節炎發病中的作用。

1 T2DM導致糖尿病性關節炎的主要途徑

Cannata等〔4〕梳理了高血糖導致OA的主要途徑，見圖1。一方面，高血糖通過氧化應激，促進腫瘤壞死因子(TNF)-α、前列腺素(PG)E2、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10等促炎癥介質的分泌，從而促進基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13、含血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)-4和ADAMTS-5等基因激活發生轉錄，而這些基因在OA中處于異常激活的狀態，參與了OA的發生、發展過程〔5〕。

另一方面，因為關節軟骨細胞以糖酵解為主，故而軟骨細胞細胞膜內存在大量的葡萄糖轉運蛋白(GLUT)。GLUT可誘導并在生理上上調葡萄糖消耗，以便最大限度地攝入葡萄糖。當關節內血糖水平升高，軟骨細胞適應局部葡萄糖水平的能力在OA期間喪失，GLUT持續過度表達，可能導致葡萄糖毒性，造成軟骨細胞凋亡、自噬和衰老〔6〕。

MMP、ADAMTS等基因的異常激活和葡萄糖毒性造成的軟骨細胞凋亡、自噬和衰老，導致了關節膠原合成減少、蛋白多糖分解和軟骨細胞活性降低，從而導致OA的發生、發展。因此，T2DM是通過氧化應激和葡萄糖毒性這兩個主要途徑而導致糖尿病性關節炎。

圖1 高血糖導致OA的主要途徑

2 Wnt/β-catenin信號通路轉導過程

在失活狀態下，β-catenin與糖原合成酶激酶(GSK)-3β、Axin、結腸腺瘤性息肉病基因蛋白(APC)和酪蛋白激酶(CK)-1形成的復合物結合，使β-catenin磷酸化進而將其降解。當Wnt/β-catenin信號通路被激活時，由Frizzled(FzD)和脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6組成的受體復合物與Wnt蛋白結合，激活細胞內的Disheveled(Dvl)蛋白，隨后，GSK-3β、APC和Axin等組成的破壞β-catenin的復合物被募集到細胞膜上，從而阻止了β-catenin的磷酸化〔7〕。β-catenin的磷酸化被阻止，β-catenin便會在細胞質內聚集，升高的β-catenin進入細胞核，激活淋巴樣增強因子(LEF)/T 細胞因子(TCF)，進而激活下游的 C-myc、G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1、MMP-7、survivin、PPAR等下游靶基因〔8〕。

3 Wnt/β-catenin信號通路與T2DM的發病機制相關

胰腺β細胞功能進行性的下降是T2DM發病機制的核心。研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在小鼠胰腺的誘導、擴張、模式化和分化等不同階段均能進行精確的調節〔9〕。小鼠胰腺/胰島細胞可以分泌多個Wnt亞型蛋白(Wnts)，并且胰島釋放的Wnts可能參與糖尿病前期β細胞的調節。Maschio等〔10〕發現，糖尿病前期小鼠胰島細胞增生，Wnts3a和5b在增生性胰島中的基因表達明顯高于對照組小鼠。Kurita等〔11〕也發現，Wnt4是β細胞中表達最為豐富的Wnts亞型蛋白，高脂高糖飼喂的小鼠胰島中Wnt4表達上調，提示Wnt4信號轉導增加與胰島素分泌增加和β細胞增殖受損有關。

除了Wnts與T2DM發病機制相關，Wnt/β-catenin信號通路的某些其他環節也發現與T2DM相關。Sacco等〔12〕發現，β-catenin的負調節因子GSK-3β參與了β細胞功能的調節，GSK-3β激酶通過調控β細胞特異性轉錄因子PDX1而抑制T2DM患者胰島素的分泌。通過對不同人群的全基因組關聯研究發現，Wnt信號通路的關鍵細胞內效應器TCF轉錄因子如TCF7L2的基因變異與T2DM有關，高脂飲食飼喂的TCF7L2基因敲除小鼠出現了糖耐量受損、胰島素敏感性受損、體重增加和脂肪組織質量增加〔13〕。

4 Wnt/β-catenin信號通路與OA的發病機制相關

在人類遺傳學研究中，Wnt/β-catenin信號轉導相關基因的改變被認為是OA發生的易感因素。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活會促進OA的發展，如R-防御素2可以通過促進軟骨內的Wnt/β-catenin信號而促進軟骨細胞向肥大軟骨細胞的分化；關節內注射米安色林可抑制β-catenin的積累，并阻止OA中異常激活的Wnt/β-catenin信號轉導〔14〕。因此，Wnt/β-catenin信號在OA的發生發展中起著重要作用，而β-catenin水平的高低是維持軟骨內環境穩定所必需的。

當Wnt/β-catenin途徑激活后，β-catenin在細胞質中上調并轉移到細胞核，在細胞核與TCF結合，使得 C-myc、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4，ADAMTS-5及骨形態發生蛋白(BMP)-2等下游靶基因激活發生轉錄，這些基因在OA中處于異常激活的狀態，參與了OA的發生、發展過程〔15,16〕。

在上述的下游靶基因中，MMP-13作為軟骨降解網絡中的一個中心節點而最受關注。Yun等〔17〕發現LEF1與β-catenin結合后，直接結合在MMP-13基因的3′-區并且通過使MMP-13啟動子DNA構象的改變而反式激活MMP-13啟動子。當軟骨細胞受到IL-1β的攻擊時，LEF1蛋白水平和基因表達增強，導致MMP-13表達增加〔18〕。在OA微環境中，MMP-13存在過度表達，其表達水平與OA的嚴重程度相對應〔19〕。MMP-13通過降解OA關節軟骨和骨中的Ⅱ型膠原發揮作用。目前，已有較多的實驗致力于研究MMPs抑制劑用來控制OA的發生發展，但在臨床試驗中，廣譜MMPs抑制劑可能導致一些疼痛和關節僵硬的副作用，稱為肌肉骨骼綜合征(MSS)。因此，開發選擇性MMP-13抑制劑是OA治療的一個潛在策略〔20〕。

ADAMTS目前發現了19種亞型，其中很多亞型都被發現參與了OA軟骨的病理生理過程，這些酶可能在軟骨基質合成代謝(如ADAMTS-2、ADAMTS-3和ADAMTS-14)、軟骨細胞分化和增殖(如ADAMTS-9、ADAMTS-10、ADAMTS-12)及促進軟骨分解代謝(如ADAMTS-7和ADAMTS-12)等各方面發揮作用〔21〕。目前研究得較多的ADAMTS-4和ADAMTS-5被證實在OA軟骨細胞中表達增加，通過增加分泌金屬蛋白酶而使細胞外基質的Ⅱ型膠原和軟骨蛋白聚糖降解增加〔22〕。

5 糖尿病性關節炎的治療現狀

OA主要的治療方案分為藥物治療和手術治療。藥物治療選用非甾體類抗炎藥、止痛藥、關節保護藥物及四環素、基質金屬蛋白酶抑制劑、炎性細胞因子抑制及記憶治療等。藥物治療大多屬對癥處理范疇。手術治療被公認最有效的為關節鏡手術，有創傷性小、恢復快且并發癥小的優點，但關節鏡對己損傷的關節軟骨無法修復，對存在關節畸形的晚期病例基本無效，部分病例在術后較長時間后仍會復發。目前，能根治OA的手術是關節置換術。但是，由于患者T2DM的存在，患者的年齡、體重指數和其他潛在的混雜因素使得術后死亡風險增加，感染率增加〔23〕。那么，抗糖尿病藥物是否對糖尿病性關節炎的預后有積極的影響呢？在英國的一項調查研究中發現，3 217例T2DM患者使用二甲雙胍治療時，與T2DM并發癥之一的OA的出現沒有相關性〔24〕。另一項調查研究也發現，沒有證據顯示，T2DM患者服用噻唑烷二酮類藥物后有改善OA的作用〔25〕。因此，尋找糖尿病性關節炎治療中存在的潛在靶點，開發能延緩其發生發展的藥物，是目前較為迫切的一項研究。

6 Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病性關節炎治療中潛在的靶點

6.1細胞外潛在靶點 在細胞外，Wnt/β-catenin信號通路的激活受不同蛋白質家族的調控，包括分泌型FzD相關蛋白(SFRPs)和Dickkopfs(DKK)。在骨關節疾病中，FzD蛋白的表達譜改變，可能是Wnt/β-catenin信號通路異常激活的原因，SFRPs能與其細胞膜受體FzD蛋白結合，抑制Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，從而調節炎癥反應和細胞外基質重塑的能力〔26〕。IL-1β會通過介導SFRP4的分泌，抑制胰島素信號轉導，在骨骼肌、脂肪組織和肝臟中引起胰島素抵抗，導致β細胞衰竭，最終導致T2DM〔27〕。SFRP5則主要通過抑制非經典Wnt/β-catenin信號通路，抑制TNF-α和IL-6的表達，從而減輕炎癥反應和胰島素抵抗〔28〕。

DKK家族是Wnt信號通路中最重要的拮抗劑之一，由脊椎動物分泌的4種蛋白(DKK 1、2、3、4)組成。其通常通過結合和抑制LRP5/6來拮抗Wnt/β-catenin信號傳導〔29〕。Theologis等〔30〕對40例56～87歲原發性膝關節OA患者和20名健康人展開研究，發現OA組關節滑液中Dkk-1水平明顯高于對照組，說明Dkk-1可能在OA退行性變過程中發揮重要作用。在T2DM方面，T2DM大鼠骨髓間充質干細胞生長活性和成骨分化潛能減弱，可能與DKK-1在骨髓間充質干細胞中的表達增加有關〔31〕。Tsentidis等〔32〕發現Dkk-1表達升高會下調T1D兒童和青少年的Wnt/β-catenin信號通路，使成骨細胞活性降低，破骨細胞信號傳導增強，對糖尿病骨病有明顯的促進作用。

sclerostin是一種由SOST基因編碼，抑制成骨細胞的糖蛋白，主要由骨細胞分泌，受激素變化和骨骼負荷的調節。sclerostin可與LRP5/6結合,阻斷Wnt/β-catenin信號通路。在OA的發生發展過程中，sclerostin表達下降，從而促進軟骨下骨硬化和增加軟骨分解代謝活性而加重小鼠膝關節OA〔33〕。當葡萄糖水平升高，sclerostin的表達增加而抑制骨細胞形成，因此，糖尿病患者成骨細胞的成骨作用可能會降低，從而導致骨密度降低，骨脆性增加〔34〕。

Wnts是一類分泌型糖蛋白，目前在人體中已發現19種。除上述Wnts與T2DM發病機制相關外，Wnts對軟骨細胞的增殖分化和骨祖細胞的合成代謝有直接影響，是維持骨骼細胞正常發育的必要條件〔35〕。體外實驗顯示，Wnt10a對OA患者的滑膜間充質干細胞(SMSCs)有明顯的抗衰老作用；Wnt5b顯著抑制SMSCs的分化；Wnt5a和Wnt10a可顯著增加SMSCs中炎性細胞因子的表達。在OA大鼠模型中，Wnt5a明顯加重關節退行性變，而Wnt10a對軟骨完整性有輕度的保護作用〔36〕。Ding等〔37〕在人OA軟骨中檢測到FzD7、Wnt3a蛋白水平的升高。同時，FzD7通過胞外富含半胱氨酸結構域(CRD)與配體Wnt3a結合，以劑量依賴的方式拮抗Wnt3a/β-catenin信號通路，具有軟骨保護作用。

綜上，在細胞外，Wnt/β-catenin信號通路受不同蛋白質家族的調控，如SFRPs、DKK和sclerostin，進而對T2DM和OA 的發生發展起到調控作用，可作為糖尿病性關節炎的潛在靶點。

6.2細胞質內潛在靶點 在正常細胞的細胞質中，β-catenin與GSK-3β、Axin2、APC和CK-1形成的復合物結合，β-catenin蛋白濃度處于較低水平。GSK-3β是細胞分化和凋亡的重要調節因子，可以調節成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，敲除GSK-3β可增加成骨細胞中β-catenin的表達〔38〕。當抑制劑滅活GSK-3β/β-catenin途徑時，會抑制MMPs和ADAMTS等下游基因的表達，抑制軟骨細胞凋亡〔39〕。在T2DM方面，篩選GSK-3β/β-catenin途徑的抑制劑是現在研究的熱點，通過藥物降低GSK-3β的表達，從而激活Wnt/β-catenin通路，使胰島β細胞增殖和質量升高，同時修復糖尿病患者的骨代謝紊亂〔40,41〕。

因此，在細胞質內，GSK-3β和β-catenin糖尿病性關節炎的值得關注的靶點。

6.3細胞核內潛在靶點 TCF是Wnt信號通路的關鍵細胞內效應器，TCF除了上述的與T2DM有關，目前的研究也發現其與OA有關。 某些藥物通過抑制小鼠原代軟骨細胞TCF/LEF啟動子活性而阻止軟骨細胞肥大分化，從而阻止軟骨進一步降解〔42〕。或通過藥物直接靶向β-catenin mRNA而調節β-catenin的表達，降低β-catenin/TCF復合物的相對轉錄活性，減輕OA小鼠模型的進展〔43〕。

6.4Wnt/β-catenin信號通路下游潛在靶點 β-catenin與TCF/LEF結合后的下游靶基因中，MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5除了是OA治療的潛在靶點，也可能是T2DM治療的潛在靶點。高糖會通過上調糖尿病性OA患者膝關節軟骨細胞MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達而激活炎癥反應〔44〕。MMPs和ADAMTS是細胞外基質(ECM)的主要分解代謝因子，過度激活會導致ECM中Ⅱ型膠原和軟骨蛋白聚糖過度降解，提示軟骨早期級聯性退變的開始。目前，一些新型抗糖尿病藥物如杜拉魯肽、利西那肽可以抑制MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達，對軟骨細胞損傷具有很強的保護作用〔45,46〕。

綜上，Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病性關節炎中起到了至關重要的作用。深入研究 Wnt/β-catenin信號通路對于闡明糖尿病性關節炎的發病機制有重要意義。目前采用針對Wnt/β-catenin信號通路的生物制劑大都停留在細胞或動物模型階段，開發通過Wnt/β-catenin信號通路作用糖尿病性關節炎的藥物，實現從科研到臨床的轉化，是未來的研究方向。