自噬調(diào)控衰老分子機(jī)制的研究進(jìn)展

李嬌 袁碩 張慶鎬，2

(1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 延吉 133022；2大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院慢性病研究中心)

老齡化被描述為一種隨時(shí)間變化的損傷積累、功能下降和環(huán)境適應(yīng)困難，并伴隨著發(fā)病率和死亡率的增加〔1〕。衰老及抗衰老的研究一直是世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿課題，在不同的真核生物中，衰老是由受損的大分子和細(xì)胞器的逐漸累積驅(qū)動(dòng)的〔1，2〕，是癌癥、糖尿病、骨骼肌減少癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病等疾病的主要危險(xiǎn)因素〔1〕。對(duì)衰老機(jī)制的研究將有助于人們了解衰老的發(fā)生，找到預(yù)防和治療衰老和年齡相關(guān)疾病的方法。

1 自 噬

自噬是真核細(xì)胞的主要降解過(guò)程，是一種由自噬相關(guān)蛋白(ATG)驅(qū)動(dòng)的進(jìn)化高度保守的機(jī)制〔3〕。自噬主要有3種類型：小自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)和大自噬(主要的自噬形式)，可分為3個(gè)階段：起始、形成和降解〔3，4〕。隔離膜的形成是自噬體形成的關(guān)鍵步驟，受多種信號(hào)機(jī)制調(diào)控，吞噬區(qū)域或所選擇的底物隔離使其伸長(zhǎng)并成熟為自噬體，即雙膜囊泡，隨后通過(guò)運(yùn)輸與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。細(xì)胞質(zhì)的自噬降解主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：提供大分子化合物(溶酶體降解的產(chǎn)物，包括氨基酸和脂肪酸)作為饑餓期間細(xì)胞的替代能源；消除受損的大分子和細(xì)胞器，從而有助于細(xì)胞的清除〔4〕。自噬涉及細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激條件的反應(yīng)，如缺氧或高溫時(shí)，迅速重組細(xì)胞功能；在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和生存及防御細(xì)胞內(nèi)微生物等方面也有重要作用。癌癥、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病)、腦卒中、肌少癥、感染和心臟病等疾病的發(fā)作均與自噬受損有關(guān)〔3～5〕。然而在體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境中，過(guò)度激活自噬被認(rèn)為在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，其有助于抵抗化療和代謝變化，維持腫瘤細(xì)胞在應(yīng)急狀態(tài)下的生存〔6〕。

2 自噬與衰老的關(guān)系

在動(dòng)物模型中，隨著年齡的增長(zhǎng)，自噬功能下降及隨之而來(lái)的蛋白穩(wěn)態(tài)繼發(fā)性衰減和蛋白毒性的累積〔7，8〕。在秀麗隱桿線蟲中，包括腸和神經(jīng)元在內(nèi)的各種組織的自噬通量水平普遍下降〔7〕；在哺乳動(dòng)物中也觀察到類似的功能下降，例如，對(duì)衰老小鼠肝臟的電鏡分析顯示自噬囊泡(AVs)形成率下降〔8〕。Levine組是第一個(gè)證實(shí)在長(zhǎng)壽突變模型中抑制自噬，可以使突變體促進(jìn)長(zhǎng)壽的功能喪失〔9〕。與野生型相比，daf-2基因發(fā)生功能缺失突變的秀麗隱桿線蟲壽命明顯延長(zhǎng)，而敲掉自噬相關(guān)基因Atg6后，daf-2突變體的壽命明顯縮短，這表明自噬在延長(zhǎng)壽命中起關(guān)鍵作用〔9〕。一些研究小組評(píng)估了過(guò)度表達(dá)自噬基因帶來(lái)的影響，Atg5過(guò)表達(dá)降低了黑色素瘤細(xì)胞的增殖、延緩衰老的進(jìn)展〔10〕。研究人員生成了在beclin1中靶向Phe121Ala突變的小鼠，其減少了beclin1與負(fù)調(diào)節(jié)因子B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(BCL)2的相互作用，即有較高水平的基礎(chǔ)自噬通量，該小鼠的健康壽命得到了明顯的改善；此外，缺乏抗衰老蛋白klotho的小鼠增加了beclin1和BCL2的相互作用，降低了自噬〔11〕。因此，破壞beclin1-BCL2復(fù)合物是增加哺乳動(dòng)物自噬、防止過(guò)早衰老、改善健康壽命和延長(zhǎng)壽命的有效機(jī)制〔11〕。

基因組不穩(wěn)定性、端粒縮短、表觀遺傳學(xué)改變、蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失、營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)失調(diào)、線粒體功能障礙、細(xì)胞衰老、干細(xì)胞喪失和細(xì)胞間通訊的改變是老化的主要特征〔1〕。值得注意的是，自噬已被證明幾乎與這些特征均密切相關(guān)，自噬可以通過(guò)減少DNA損傷產(chǎn)生的活性氧(ROS)生成和促進(jìn)DNA修復(fù)蛋白的循環(huán)來(lái)緩解基因組不穩(wěn)定性的影響〔12〕。盡管自噬不能恢復(fù)或停止端粒的損耗，但研究表明，端粒功能障礙直接刺激自噬，促進(jìn)癌前細(xì)胞的死亡〔13〕。自噬被認(rèn)為與表觀遺傳改變沒(méi)有直接關(guān)系，但它在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定〔14〕、營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)〔15〕和通過(guò)線粒體自噬維持線粒體健康〔16〕方面均有重要意義。自噬與衰老之間的關(guān)系復(fù)雜需要進(jìn)一步的探討，但自噬已被證明在維護(hù)干細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用〔17〕。自噬還可以通過(guò)調(diào)控吞噬活性和炎癥水平維持適當(dāng)?shù)拿庖吖δ?細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵組成部分)〔18〕。綜上，自噬水平升高可以延緩衰老。在自噬調(diào)控衰老的過(guò)程中，胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(IIS)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)信號(hào)通路、單磷酸腺苷(AMP)依賴的蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路和Sirtuin通路發(fā)揮了重要作用〔1〕。

2.1胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1信號(hào)通路(IIS) 從酵母到哺乳動(dòng)物，胰島素/IGF-1信號(hào)通路(IIS)高度保守，在機(jī)體的代謝、營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)、繁殖和衰老等方面起著重要作用，是研究最多的通路之一，也是第一個(gè)被證實(shí)能夠影響衰老的通路〔1，19〕。AGE-1和daf-2是IIS的兩個(gè)關(guān)鍵上游組成部分，它們可以調(diào)節(jié)各個(gè)生理方面。胰島素或胰島素樣肽與其膜受體(胰島素/IGF-1受體)相互作用時(shí)，受體被自身磷酸化并通過(guò)磷酸化激活其底物(IRS/CHICO/IST-1)，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，PI3K將磷脂酰脂醇二磷酸(PIP)2轉(zhuǎn)換為PIP3，蛋白激酶B(AKT)被磷酸化并激活，導(dǎo)致IIS被激活〔19〕。衰老與自噬活性水平的降低有關(guān)，而自噬活性的降低部分是IIS調(diào)節(jié)失調(diào)的結(jié)果，研究表明IIS通路的激活可以通過(guò)AKT激活mTORC1和(或)抑制叉頭框蛋白(Fox)O信號(hào)來(lái)抑制自噬〔19，20〕。秀麗隱桿線蟲的daf-2是表達(dá)胰島素受體家族的唯一成員，可以影響生殖和細(xì)胞生長(zhǎng)，而daf-2的這兩種功能依賴于某些自噬基因的活性，自噬機(jī)制似乎在daf-2的下游發(fā)揮作用，daf-2(-)與野生型蠕蟲相比，daf-2(-)突變體的自噬活性明顯增強(qiáng)，線蟲的壽命延長(zhǎng)了兩倍以上〔21〕。在哺乳動(dòng)物中，胰島素/IGF-1受體通過(guò)激活一系列保守激酶抑制FOXO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16，而FOXOs轉(zhuǎn)錄因子是應(yīng)激反應(yīng)、代謝、細(xì)胞周期和生存的重要調(diào)節(jié)因子。在營(yíng)養(yǎng)剝奪(和抑制IIS)條件下，F(xiàn)OXO可以促進(jìn)幾種自噬相關(guān)基因(例如，LC3、beclin1等)的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)自噬水平，誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型的蛋白降解〔20〕。熱休克因子(HSF)-1也是IIS下游關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)HSF-1可以介導(dǎo)TOR信號(hào)通路下游核糖體S6激酶(S6K)的突變導(dǎo)致自噬水平升高從而引起秀麗隱桿線蟲壽命的延長(zhǎng)〔19〕。在線蟲模型研究中，蘆丁(Rutin)通過(guò)胰島素/IGF-1 (IIS)/DAF-16/FoxO信號(hào)通路誘導(dǎo)抗氧化防御和伴侶蛋白，增加自噬活性，并可能延緩衰老和年齡相關(guān)疾病的發(fā)生〔22〕。這些研究結(jié)果提示，抑制IIS信號(hào)通路可以誘導(dǎo)自噬水平升高，從而延緩衰老。

2.2mTOR信號(hào)通路 mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和自噬等上游通路的匯合點(diǎn)〔23〕。細(xì)胞內(nèi)存在mTORC1和mTORC2兩個(gè)不同的復(fù)合物，它們由不同的蛋白集合體組成，表現(xiàn)不同的細(xì)胞功能〔23〕。mTORC2調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和細(xì)胞骨架，并且可以磷酸化AKT，導(dǎo)致mTORC1的激活，也可以通過(guò)PI3K-AKT途徑，磷酸化并失活結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物(TSC)1/2，從而激活Rheb(mTOR活化所必需的刺激蛋白)，進(jìn)而激活mTORC1，此外，由于mTORC2通過(guò)磷酸化和滅活Ⅱa類組蛋白脫乙酰基酶來(lái)促進(jìn)FOXO1和FOXO3向細(xì)胞質(zhì)遷移，抑制其在核內(nèi)積累，使其失活，因此mTOR途徑可以負(fù)面調(diào)節(jié)FOXO〔22，23〕。研究表明，蛋氨酸代謝物(同型半胱氨酸)可以激活mTORC1，而同型半胱氨酸隨著年齡的增長(zhǎng)而不斷累積〔24〕，這可以表明衰老與mTORC1活性呈正相關(guān)。因此，mTORC1活性的增加是自噬活性隨年齡增長(zhǎng)而普遍下降的一個(gè)原因。自噬激酶(ULK)1-Atg13-FIP200復(fù)合物作為mTORC1的直接靶點(diǎn)，也是自噬的重要啟動(dòng)子，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1通過(guò)與該復(fù)合物的直接相互作用抑制自噬，介導(dǎo)磷酸化依賴抑制Atg13和ULK1的激酶活性；在饑餓條件下或雷帕霉素治療下，mTOR從復(fù)合物中解離，導(dǎo)致ULK1的去磷酸化依賴性激活、ULK1介導(dǎo)的Atg13、FIP200和ULK1自身的磷酸化，從而觸發(fā)自噬；mTORC1還可以通過(guò)刺激活化下游的翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(4E-BP1)和S6K調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞自噬〔23，25〕。與前面描述的daf-2突變一樣，秀麗隱桿線蟲中TOR信號(hào)的失活也會(huì)導(dǎo)致自噬水平的升高，也表現(xiàn)為壽命延長(zhǎng)兩倍以上〔20，25〕。TOR活性降低可延長(zhǎng)多種生物模型(如酵母、果蠅、線蟲、嚙齒動(dòng)物)的壽命，而且研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠下丘腦的mTOR活動(dòng)增加，容易促進(jìn)老年肥胖。而雷帕霉素作為經(jīng)典的mTOR抑制劑，通過(guò)激活自噬，可以顯著改善衰老的這些效應(yīng)〔23〕。在延齡草總皂甙(TTM)的干預(yù)下，發(fā)現(xiàn)TTM通過(guò)上調(diào)Rheb、下調(diào)mTOR，可以改善D-半乳糖致衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，挽救自噬功能障礙，發(fā)揮抗衰老作用〔26〕。這些研究結(jié)果提示，抑制mTOR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以誘導(dǎo)自噬水平升高，從而延緩衰老。

2.3AMPK信號(hào)通路 AMPK是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)AMP/三磷酸腺苷(ATP)比率變化的能量傳感器，也被認(rèn)為是脂類的糖原代謝的主要調(diào)節(jié)因子，AMPK在衰老的研究中具有重要性〔27〕。多項(xiàng)研究表明，衰老對(duì)AMPK活性有較強(qiáng)的抑制作用，AMPK活性與壽命呈正相關(guān)。與野生型蠕蟲相比，缺乏AMPK的秀麗隱桿線蟲壽命減少了12%，而AMPK過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致壽命增加了13%〔28〕。在AMPK下游，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活因子(PGC)-1α可以調(diào)節(jié)抗氧化基因以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，AMPK活性降低可增加線粒體ROS并導(dǎo)致早衰〔29〕。AMPK是自噬的有力啟動(dòng)子。在饑餓、缺血、缺氧和代謝產(chǎn)物積累等因素作用下，AMP/ATP的比值升高，導(dǎo)致AMPK激活，增加細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+水平，從而激活沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1誘導(dǎo)自噬的升高，SIRT1也可通過(guò)去乙酰化肝激酶(LK)B1中的賴氨酸殘基，促進(jìn)其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，催化AMPK磷酸化和激活〔27〕。此外，AMPK可以通過(guò)磷酸化和激活自噬起始激酶ULK1來(lái)促進(jìn)自噬，AMPK也可以通過(guò)磷酸化mTORC1、ULK1和PIK3C3/VPS34復(fù)合物中的自噬相關(guān)蛋白直接促進(jìn)自噬，或通過(guò)磷酸化TSC2、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子下游的自噬相關(guān)基因(如FOXO3、TFEB和BRD4)的表達(dá)等方式間接促進(jìn)自噬〔30〕。最新研究表明，越桔花青素(BA)通過(guò)AMPK-mTOR信號(hào)途徑誘導(dǎo)自噬，進(jìn)而降低衰老誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，延緩衰老〔31〕。在秀麗隱桿線蟲模型中，水楊酸和乙酰水楊酸通過(guò)激活A(yù)MPK和叉頭轉(zhuǎn)錄因子DAF-16/FOXO可以激活自噬從而延長(zhǎng)蠕蟲的壽命〔32〕。這些研究結(jié)果提示，激活A(yù)MPK信號(hào)通路可以誘導(dǎo)自噬水平升高，從而延緩衰老。

2.4Sirtuins Sirtuins是一類NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶，包括Sirt1-Sirt7共7個(gè)成員，在進(jìn)化中高度保守〔33〕。在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞代謝、線粒體穩(wěn)態(tài)、自噬、DNA修復(fù)、凋亡、氧化/抗氧化平衡和衰老等方面具有重要作用，其活性的增加被證明與酵母、果蠅、蠕蟲和哺乳動(dòng)物的壽命延長(zhǎng)有關(guān)〔33〕。哺乳動(dòng)物和人體組織(包括肝臟、心臟、腎臟、大腦和肺)中SIRT1的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平隨年齡增長(zhǎng)而普遍下降〔34〕。多項(xiàng)體內(nèi)外研究表明SIRT1在老化血管組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)和巨噬細(xì)胞中SIRT1的缺失加速了血管的老化〔35〕。與對(duì)照組相比，哺乳動(dòng)物大腦特異性表達(dá)SIRT1可顯著延長(zhǎng)小鼠的壽命(雌性小鼠約16%，雄性小鼠約9%)〔36〕。激活SIRT1還能抑制紫外線照射引起的皮膚成纖維細(xì)胞老化〔37〕。SIRT1被證實(shí)與自噬相關(guān)基因(Atg5、Atg7、Atg8和LC3)有關(guān)，促進(jìn)自噬小體的形成，從而提高細(xì)胞的自噬水平〔33〕。SIRT1可以通過(guò)與TSC2相互作用，負(fù)調(diào)控mTOR信號(hào)通路恢復(fù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬損傷，從而提高胚胎干細(xì)胞的存活率，SIRT1也可以通過(guò)去乙酰化并激活FOXO3，它是IIS和mTOR通路的下游效應(yīng)器，參與損傷線粒體的自噬清除和線粒體的修復(fù)〔34〕。研究表明，Sitr1-/-成纖維細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下可以導(dǎo)致自噬關(guān)鍵蛋白的乙酰化增強(qiáng)從而抑制自噬〔38〕。尿凝素A可能通過(guò)激活miR-34a介導(dǎo)的SIRT1/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬水平升高發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并可能有助于阻止D-半乳糖誘導(dǎo)的腦老化〔39〕。上述研究結(jié)果提示，增加SIRT1的表達(dá)可以誘導(dǎo)自噬水平升高，從而延緩衰老。

綜上，衰老是由受損的大分子和細(xì)胞器的逐漸累積驅(qū)動(dòng)的，自噬被證明在健康跨度和壽命延長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，自噬水平升高可以延緩衰老。IIS、mTOR、AMPK和Sirtuins信號(hào)通路是影響衰老速度的主要調(diào)節(jié)途徑，它們的調(diào)節(jié)被證明可以延長(zhǎng)壽命，并且自噬可能是這些途徑的必要中介(如圖1所示)。基于這些數(shù)據(jù)我們希望能重新使用藥物、聯(lián)合用藥或開發(fā)新的藥物或基因干預(yù)來(lái)延緩衰老的進(jìn)展。此外，自噬還與氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等密切相關(guān)，為研究抗衰老提供了更廣泛的思路。

圖1 自噬調(diào)控衰老的分子機(jī)制