基于口腔內微生物群落分析牙周炎及阿爾茨海默病的相關性

連健 吳志輝

(1福建衛生職業技術學院醫技系，福建 福州 350101；2福建省婦幼保健院檢驗科)

慢性牙周炎(CP)又稱為成人牙周炎，是牙周組織發生的慢性感染性炎癥，長期存在的慢性齦炎向牙周膜、牙槽骨和牙骨質深部擴展而引起的，往往會影響口腔咀嚼系統的功能、導致牙齒松動、牙槽骨破壞和牙齒缺失等癥狀〔1〕。導致慢性牙周炎的始動因子是菌斑微生物，菌斑微生物會造成牙周感染，其中非附著性齦下菌斑和牙周炎的關系更加緊密〔2〕。慢性牙周炎性組織內浸潤的T細胞、巨噬細胞等炎性細胞產生釋放促炎因子，如白細胞介素(IL)-6、IL-1β等，并可將促炎因子釋放到體循環中，由于慢性牙周炎疾病周期很長，血漿炎癥因子的水平不斷增加，這就致使即使是口腔的低程度感染也可能由于血液中炎癥因子的水平增高而引起全身炎性反應〔3〕。阿爾茨海默病(AD)的特點是有明顯的炎癥特征，可能是由于炎癥因子對大腦組織造成了慢性或者進行性的器質性損害，使患者在生活上表現為記憶障礙、抽象思維障礙、空間結構障礙、精神行為障礙及獨立生活能力喪失〔4，5〕。AD是在老年時期多見的一種慢性進行性疾病，是一種進行性發展的致死性神經退行性疾病，病情存在不可逆性，使老年人的認知能力和日常生活能力逐漸喪失〔6〕。目前慢性牙周炎和全身系統性疾病的關聯性引起了越來越多研究者的興趣，因此從口腔微生物群落出發探究牙周炎和全身系統性疾病相關性的研究也應運而生。慢性牙周炎可能會對心血管、呼吸、消化、內分泌等系統造成不良影響，并且牙周炎患者與患有類風濕關節炎、肺疾病、慢性進行性肝病和心血管疾病等患者在口腔核心微生物的組成、豐度及代謝途徑等方面存在關聯性〔7〕。口腔微生物組成以非附著性齦下菌斑中的微生物種類最多，并且AD患者腦組織中檢測出的微生物毒力因子的主要來源也是齦下菌斑。所以選用齦下菌斑中的微生物群落作為研究牙周炎和AD相關性的契合點也是符合邏輯的。

1 資料與方法

1.1研究對象 資料信息及菌斑標本均來自2017年6月至2019年8月在福建醫科大學附屬第一醫院進行就診的患者或體檢的健康人群，共90例，平均年齡(69.6±13.5)歲。納入標準：年齡大于55歲，性別不限，能夠完成簡易精神狀態評價(MMSE)量表評估，配合口腔檢查，均簽署本次研究的知情同意書。

(1)對照(A)組：30例。受檢人群符合牙齦健康、牙周袋深度(PD)≤3 mm、牙周探診出血率(BOP)率<10%，無臨床附著喪失(CAL)，口腔內肉眼不可見明顯色素和牙結石，口腔內無種植體，取樣牙位及其同牙合同側鄰牙無義齒。(2)牙周炎(B)組：受檢人數為30人，符合《牙周病學》中牙周炎的診斷標準確定為中重度牙周炎，口腔內無種植體，取菌斑的牙位無根面齲、無義齒，其合同側鄰牙無義齒〔1〕。(3)AD伴牙周炎(C)組：受檢人數為30人，符合2011年AD診斷標準(NIA-AA)確定為AD患者，同時符合《牙周病學》中牙周炎的診斷標準確定為中重度牙周炎〔1〕。

排除標準：受檢人患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病等嚴重全身系統性疾病；受檢人患有AD之外影響認知的其他疾病；受檢人在3個月內進行過牙周病相關治療及手術，服用過抗菌藥物或者非甾體類抗炎藥。

1.2實驗方法 (1)中重度牙周炎診斷標準：根據第四版《牙周病學》中的診斷標準〔1〕，判定為中重度牙周炎的標準是牙齦有炎癥、探診出血、出現牙周袋、附著喪失，可能會出現牙周溢膿、牙齒松動。牙根分叉區出現病變，牙槽骨吸收加重。(2)精神狀態評價：MMSE評分在國際通用，實施方法較為簡單，可以有效篩查老年癡呆。由評價者進行提問及記錄，包括了定向力(時間定向力和地點定向力)10分，記憶力(即時記憶力和延時記憶力)3分，回憶能力3分，語言能力9分，注意力和計算力5分，滿分為30分，回答正確一項計1分。其中分數在27～30分為正常，分數<27即判定為認知功能障礙。分數在21～26分判定為輕度癡呆；分數在10～20分判定為中度癡呆；分數<10分判定為重度癡呆。日常生活活動能力(ADL)量表評分：由軀體生活自理(PSMS)量表和工具性日常生活(IADL)量表兩部分組成。PSMS反映生活自理能力，IADL反映使用工具的能力。通過對問題的評價和記錄，患者能夠做計為1分；做時有一些困難，但是可以完成計為2分；需要幫助才能完成計為3分；根本沒法做計為4分。當病人從來沒有做過的，但可以勝任的得1分；從來沒有做過，但有困難，而不需要別人來幫助，可以得2分；從來沒有做，但需要幫助可以得3分；從來沒有做，也無法完成時評定為4分。評分范圍為20～80分，>23分認為有認知障礙。蒙特利爾認知評估量表(MoCA)評分：評定內容包括語言、命名、注意力、抽象思維、延遲記憶、計算和定向力、視結構/執行功能7個認知領域的11個檢查標準，滿分30分，≥26分屬于認知功能正常，因為此量表受教育程度的影響，因此對教育年限小于12年的患者在總分基礎上增加1分，用于校正因文化水平不同造成的偏差。(3)臨床信息收集：受檢人群的剩余牙數(不計智齒)、探診出血率、探診深度、臨床附著喪失水平。(4)牙齦下菌斑采集：受檢人均在取樣前3 h內禁止飲食和刷牙，用無菌水漱口后進行取樣。對照組樣本取前牙或后牙齦上菌斑，其他兩組取樣符合要求的牙周探診深度最深，沒有出現溢膿的牙齦下菌斑。取樣后立刻封存于2 ml的無菌凍存管并放入冰盒中，在冰浴條件下快速轉移至-80℃的冰箱保存。(5)DNA的提取及高通量測序：使用E.Z.N.ASoil DNAKit基因組DNA提取試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)，嚴格按照使用說明提取所有菌斑樣本的總DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本完整性，熒光儀檢測樣本DNA的純度和濃度。設置PCR引物、體系、參數進行PCR擴增，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(上海時代生物科技有限公司)對DNA進行鑒定和純化，構建文庫。在蘇州金唯智生物科技有限公司進行高通量測序及數據處理，篩選得到高質量的clean data數據，在97%的相似水平下進行操作分類單元(OTU)聚類，進行物種分類注釋。(6)Venn圖：對得到的操作分類單元進行分析，繪制物種Venn圖，統計共有及獨有物種數目，獲得各組物種組成相似和重疊的情況。(7)細胞因子檢測：使用酶標儀(北京普天新橋技術有限公司)采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對受檢人群血液中的IL-6、IL-1β水平進行檢測比較，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1剩余牙數、牙周臨床指標比較 C組剩余牙數明顯少于A組與B組(P<0.05)。C組BOP、PD、CAL均明顯高于A組和B組，B組明顯高于A組(均P<0.05)。見表1。

2.2菌斑中微生物群落分析 通過深度測序后，從每組30例受檢人獲得共計90個樣品，97%的相似度下進行OTU聚類后共產生1 125個操作分類單元，每個操作分類單元都有相應的細菌物種。利用維恩(Venn)圖能夠簡明地觀察到各組樣品的重疊OTU數量和不同OTU數量。得到3組的組內特有操作分類單元，可以看出3組細菌物種的豐富程度。分別統計A組、B組、C組的操作分類單元數目，共發現738個、643個及925個操作分類單元，其中，A組與B組共享約59.10%的操作分類單元，A組與C組共享約54.99%的操作分類單元，B組與C組共享約55.86%的操作分類單元。A組、B組、C組自身特有的操作分類單元數分別為110、43、248個，顯示了C組細菌物種豐富程度最高，其次是A組，最低的是B組。

表1 3組MMSE量表評分、剩余牙數和 牙周臨床指標比較

3組核心微生物經過統計后。發現C組中核心微生物最多，有40種，其次是B組，有35種，最低的是A組，有24種。并且經過研究發現，經典的牙周致病菌福賽坦氏菌(Tf)、牙齦卟啉單胞菌(Pg)、中間普氏菌(Pi)、具核梭桿菌(Fn)、齒垢密螺旋體(Td)、直腸彎曲桿菌(Cr)均存在于3組的牙齦下菌斑核心微生物群中。

分析A、B、C組所有的齦下菌斑標本，其中98.56%的微生物由7個菌門組成，互養菌門的平均相對豐度占比為2.13%，放線菌門的平均相對豐度占比為3.56%，螺旋體的平均相對豐度占比為11.61%，梭桿菌門的平均相對豐度占比為12.88%，厚壁菌門的平均相對豐度占比為13.39%，變形桿菌門的平均相對豐度占比為14.37%，擬桿菌門(Bacteroidetes)的平均相對豐度占比為40.62%。對3組齦下菌斑標本的微生物中這7個菌門的平均相對豐度進行對比，見表2。C組互養菌門、螺旋體、梭桿菌門、擬桿菌門相對豐度顯著小于B組(P<0.05)，放線菌門、厚壁菌門、變形菌門相對豐度顯著大于B組(P<0.05)。C組螺旋體、梭桿菌門、厚壁菌門相對豐度顯著大于A組(P<0.05)，放線菌門、變形菌門、擬桿菌門相對豐度顯著小于A組(P<0.05)。

表2 3組經典牙周致病菌相對豐度對比

2.3齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌檢出率比較 B組牙齦卟啉單胞菌檢出率(76.67%)顯著高于A組(43.33%)，而C組檢出率為100%，顯著高于其他兩組(P<0.05)。

2.4血清和齦溝液中炎癥因子水平比較 無論是血清中還是齦溝液中，B組IL-6、IL-1β水平均明顯高于A組，而C組IL-6、IL-1β水平均明顯高于其他兩組(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清和齦溝液中IL-1β、IL-6水平

2.5MMSE、ADL、MoCA評分比較 C組MMSE評分明顯低于A組與B組(P<0.05)。C組ADL評分明顯高于A組與B組，差異具有統計學意義(P<0.05)。B組的MoCA評分均明顯低于A組，而C組的MoCA評分均明顯低于其他兩組(P<0.05)。見表3。

3 討 論

目前的許多關于口腔內微生物群的研究都是基于口腔環境健康的人群，通過分析口腔內的菌群組成從而推測與人體其他疾病之間的關聯性〔8，9〕。但是事實上，在其他疾病與牙周疾病共同存在時，根據疾病的狀態均有相應的核心微生物群，這種核心微生物群的存在保證了菌群的生態環境的穩定〔10～12〕。因此，對不同口腔狀態下及口腔疾病伴其他疾病時的核心微生物群進行了解，對疾病的相互影響及疾病的防治都有一定的指導意義。本研究顯示同時患有AD和牙周炎患者要比單純的牙周炎患者有更差的牙周健康狀況，并且剩余的牙數也更少；患有牙周疾病后牙周環境中的核心微生物種類會增多，提示可能當牙周炎患者伴有AD時，原本的牙周致病菌的種類變化導致了菌群的比例失調，而菌群的環境狀態失調導致了某些牙周致病菌群的代謝更加活躍，以至于牙周情況更差〔13，14〕；牙齦卟啉單胞菌及其毒性產物可能通過血腦屏障進入大腦，這些病原體通過破壞血管的完整性直接或間接對大腦產生影響，導致長期的慢性炎癥反應，并最終導致神經退行性疾病〔15，16〕。有報道顯示IL-6參與了牙周炎的主要病理過程，并且在AD患者的神經炎斑點中和斑點周圍及皮質和海馬體中IL-6的含量水平都非常高，大量IL-6的分泌和激活有可能是導致AD發病的重要因素〔17，18〕。本研究結果表明，精神狀態量表評分結果差的牙周炎患者比單純牙周炎的患者在牙周臨床指標中表現更差，剩余牙數也更少，預示著牙周炎加重了認知功能的損害。

綜上，牙周炎的發生常常在40歲以后，在50歲后達到高峰，而AD多發于55歲后，在70歲后到達高峰〔19，20〕。時間順序上來說，牙周炎和AD的關系符合時間關聯性的邏輯與合理性，所以有理由認為牙周炎可能是影響AD的危險因素之一。