miR-155通過靶向調控TGFBR1和TGFBR2抑制AMI誘導的心肌纖維化

黃仕美 汪元河 羅亞 楊小蓉 劉樹馨 祝勁松

(貴州醫科大學 1法醫學院法醫臨床學教研室，貴州 貴陽 550004；2附屬醫院綜合病房；3貴州中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科)

急性心肌梗死(AMI)是引起心源性猝死的常見類型〔1〕。及時準確地確診對AMI的治療、預后及法醫學鑒定有至關重要的作用。然而，到目前為止，AMI的診斷和治療尚無有效的策略。

轉化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路心肌修復重要的調節因子，與AMI發生發展密切相關，Jin等〔2〕研究發現骨形態發生蛋白(BMP)-7通過拮抗TGF-β1信號通路減弱心肌纖維化，從而發揮心臟保護作用。TGF-β信號最初由其Ⅰ型和Ⅱ型跨膜受體(TGFBR1和TGFBR2)介導，TGF-β活化后與TGFBR2，TGFBR1結合形成異四聚體。當TGFBR1被激活，便將其所含帶的信號轉導給胞質區的信號傳導分子Smads。Yang等〔3〕研究發現TGF-β信號轉導相關基因TGFB1、TGFBR1、SNAI1和TWIST1的多態性與子宮內膜癌易感性相關。

微小RNA(miRNAs)是非編碼RNA家族的一員，長度為18～25個核苷酸〔4〕，近年來，研究證實包括miR-378〔5〕、miR-184〔6〕、miR-214〔7〕等多種miRNA與心肌纖維化、AMI等多種心血管疾病病理生理進程有關。本研究旨在探討miR-155對AMI小鼠心肌纖維化進程及心功能的影響及對心肌成纖維細胞(CFs)增殖和周期的調節，分析miR-155對TGFBR1/TGFBR2調控作用，闡明miR-155在AMI中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 C57/BL6小鼠由貴州醫科大學動物實驗中心提供，本研究中小鼠的處理均符合實驗動物管理和使用委員會的要求與規定。CFs購自中國科學院上海細胞庫，qRT-PCR試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質分析試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒、TRIzol?試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，LipofectamineTM2000購自Gibco公司，一抗TGFBR1、TGFBR2、內參GAPDH及辣根過氧化物酶標記的二抗購自Abcam 公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和載體購自Promega公司，miR-155 mimic及其陰性對照購自吉瑪公司。

1.2方法

1.2.1外周血采集 收集貴州醫科大學附屬醫院收治的93例AMI患者，并選取50例同期的健康志愿者(對照組)。受試者均于清晨空腹狀況下抽取外周靜脈血約3 ml，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝血管中，快速上下混合。所有樣本經貴州醫科大學醫學倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2.2細胞培養和轉染 CFs細胞株使用含10%胎牛血清的杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)培養基培養。待CFs生長至70%～90%融合時，按照轉染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書對細胞進行轉染。

1.2.3qRT-PCR檢測 使用Trizol提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR，miR-155表達水平以U6為內參，TGFBR1，TGFBR2和NPPA的mRNA表達水平以GAPDH為內參，qRT-PCR結果以2-ΔΔCt值形式得到。

1.2.4雙熒光素酶報告基因實驗 通過TargetScan發現miR-155與TGFBR1和TGFBR2的3′-非編碼區(UTR)的潛在結合位點，構建TGFBR1野生型(WT)3′-UTR熒光素酶報告基因質粒pMIR-WT-TGFBR1和突變型(Mut)報告基因質粒pMIR-Mut-TGFBR1，TGFBR2 WT報告基因質粒pMIR-WT-TGFBR2和Mut報告基因質粒pMIR-Mut-TGFBR2，將TGFBR1/TGFBR2 WT或Mut報告基因質粒與miR-NC，miR-155 mimic，NC-inhibitor或miR-155 inhibitor共轉染進CFs。轉染24 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組的熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液提取各組CFs蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取上樣緩沖液與樣品混合并置于95℃變性10 min。蛋白樣品以每孔50 μg加到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中，室溫封閉2 h。將TGFBR1抗體(1∶500)，TGFBR2抗體(1∶500)，P-smad2抗體(1∶500)，P-smad3抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)加入至PVDF膜，GAPDH為內參。4℃孵育過夜。加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗1 h，ECL劑顯色，暗室下顯影。

1.2.6CCK8實驗 以2 000個/孔的量將CFs接種到96孔板，按照CCK-8試劑盒制造商說明書，檢測CFs增殖，在450 nm波長，測定每孔光密度值。

1.2.7流式細胞法 將對數生長期的CFs收集于5 ml離心管中，用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通離心機100 r/min離心5 min后棄上清，再用預冷的PBS洗滌一次，100 r/min離心5 min后棄上清，收集細胞于同一5 ml流式離心管中，然后用4℃預冷的70%乙醇固定細胞1 h。去除乙醇后用PBS洗滌1次，用細胞染色液重懸細胞，并調整細胞密度為1×106個/ml，最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.8構建AMI小鼠模型 C57/BL6小鼠隨機分為Sham組、AMI組、AMI+miR-155組各6只。AMI組小鼠用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。胸骨左緣第2～4肋開胸，識別前降支走行范圍，7/0滑線結扎左前降支，當結扎區域顏色轉為蒼白，心電圖示波為AMI表現時確認模型構建成功。Sham組小鼠開胸但不結扎左冠狀動脈。其余步驟同AMI組。AMI+miR-155組小鼠采用miR-155 mimic慢病毒進行心肌局部注射。

1.2.9小鼠心功能檢測 10%水合氯醛腹腔注射對小鼠進行麻醉，然后心臟彩超檢查各組小鼠并記錄左室射血分數(LVEF)。

1.2.10Masson染色 小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟至水，用蘇木素染液染核10 min，充分水洗后用鹽酸酒精分化，再蒸餾水洗。用Masson麗春紅酸性復紅液10 min。1%磷鉬酸水溶液分化5 min，甩掉磷鉬酸后直接用苯胺藍染5 min。再依次用95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.2.11天狼星紅染色 小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟水化，天狼星紅染色液染色10 min，稍微沖洗后用Mayer蘇木素染色液染色8 min，流水沖洗10 min。常規梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-155在AMI患者中表達降低 對照組血清中miR-155的相對表達量(1.00±0.12)顯著高于AMI組(0.74±0.09；t=14.616，P<0.001)。

2.2miR-155對AMI小鼠左心室功能及纖維化的影響 AMI組miR-155表達量(0.34±0.09)明顯低于Sham組(1.00±0.14，t=9.714，P<0.01)。AMI組LVEF明顯低于Sham組，而AMI+ miR-155組LVEF明顯高于AMI組(P<0.01)。AMI+miR-155組NPPA mRNA表達水平明顯低于AMI組(P<0.01)。見表1。小鼠心肌組織Masson染色結果顯示，AMI小鼠心肌組織中有大量膠原纖維沉積于心肌細胞間隙，而AMI+miR-155組小鼠心肌膠原纖維分布較AMI小鼠明顯減少。天狼星紅染色結果也顯示，上調miR-155表達能抑制AMI小鼠心肌纖維化進程，見圖1。

2.3TGFBR1和TGFBR2是miR-155的靶基因 在CFs中轉染miR-155 mimic或inhibitor及各自陰性對照，在熒光顯微鏡下的觀察結果顯示，miR-155 mimic組中miR-155表達明顯高于miR-NC組，而miR-155 inhibitor組中miR-155表達明顯低于NC inhibitor組(P<0.01，圖2)，表明轉染成功。TargetScan篩選結果表明miR-155在TGFBR1的3′-UTR上具有潛在的結合位點，并且雙熒光素酶試驗結果顯示，miR-155 mimic和pMIR-WT-TGFBR1共轉染進CFs時，熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低(P<0.01)，而miR-155 inhibitor和pMIR-WT-TGFBR1共轉染時，熒光素酶活性較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)，但miR-155 mimic和inhibitor對pMIR-Mut-TGFBR1的熒光素酶活性均無明顯影響。另一方面，通過上述實驗發現miR-155也能特異性結合TGFBR2的3′-UTR，表明TGFBR2也是miR-155的靶基因。見表2。

表1 各組LVEF和NPPA mRNA比較

圖1 miR-155對AMI小鼠左心室功能及纖維化的影響(×20)

圖2 熒光顯微鏡觀察CFs轉染后miR-155的表達(×500)

表2 TargetScan和雙熒光素酶報告基因試驗驗證TGFBR1、TGFBR2是miR-155的靶基因

2.4miR-155負性調控TGFBR1和TGFBR2表達 miR-155 mimic組中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表達均明顯低于miR-NC組(P<0.01)，而miR-155 inhibitor組中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表達較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)。見圖3、表3。

2.5miR-155對CFs增殖和周期的影響 miR-155 mimic組OD值明顯低于miR-NC組(P<0.01)，而miR-155 inhibitor組的OD值較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)。轉染miR-155 mimic能導致S期細胞比值較miR-NC組明顯降低(P<0.01)，而轉染miR-155 inhibitor則促進了細胞的S期阻滯(P<0.01)。見表3。

1～4：miR-NC組、miR-155 mimic組、NC inhibitor組、miR-155 inhibitor組圖3 miR-155負性調控TGFBR1和TGFBR2的表達

表3 各組TGFBR1、TGFBR2 mRNA表達及CFs增殖及S期細胞比較

2.6miR-155通過調控Smad信號通路抑制EndMT 與NC組相比，在缺氧的刺激下，CFs中TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表達明顯升高，但轉染miR-155 mimic能明顯抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。但在共轉染miR-155 mimic和TGFBR1/TGFBR2的細胞中，miR-155的調控效果會因TGFBR1/TGFBR2過表達而被逆轉，圖4、表4、表5。

1～4：NC組、Hypoxia組、Hypoxia+miR-155組、Hyporia+miR-155+TGFBR1/2組圖4 Western印跡檢測TGFBR1、TGFBR2、P-smad2和P-smad3的表達

表4 各組P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR1蛋白 表達

表5 各組P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR2蛋白 表達

3 討 論

在AMI發病過程中，由于冠狀動脈血流突然中斷，導致供血區域的心肌細胞缺血缺氧壞死，繼而引發一系列病理生理過程〔8〕。多種miRNAs證實為 AMI后重構或誘導血管生成的重要基因調控因子〔9，10〕。Ma等〔11〕研究表明，MiR-532-5p通過靶向PDCD4減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡；Fan等〔12〕發現過表達miRNA-210可刺激HGF表達，誘導改善左心室重構，從而改善心功能，促進梗死心肌的血管生成。雖然當前已報道了多種miRNA與心肌梗死的關系，但miR-155在AMI中的作用目前尚不清楚。本研究提示miR-155表達的異常變化可能與AMI有關。miR-155能改善AMI小鼠的左心室功能，對心肌纖維化具有抑制效果。

研究顯示，TGF-β在可誘導CFs分化為肌成纖維細胞，TGFBR1和TGFBR2是TGF-β信號通路中的關鍵因子，TGF-β需通過與特異性受體TGFBR1，TGFBR2結合，才能發揮生物學作用〔13〕。在本研究結果表明miR-155能與TGFBR1和TGFBR2的3′-UTR特異性結合并負性調控兩者的表達。

CFs的增殖能力是調控心肌纖維化過程的一個重要因素，過度增殖的CFs也能導致心肌纖維化的發生〔14〕。本研究結果表明上調miR-155表達能抑制細胞的增殖和S期阻滯，與之相反的是，下調miR-155表達能促進CFs的上述生物學行為。這提示miR-155可能抑制心肌纖維化發生。

內皮細胞轉化(EndMT)與胚胎發生、損傷修復、組織新生、腫瘤進展和纖維化密切相關，EndMT可誘導成纖維細胞產生基質，從而加速心肌纖維化的進程，TGF-β1最近被證實是腎小管內皮細胞EndMT的重要觸發因子〔15〕。研究表明缺氧等刺激因素可以誘導 EndMT過程〔16〕，發現在缺氧條件下，TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表達明顯升高，但過表達miR-155能抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。而值得注意的是，上調TGFBR1或TGFBR2表達均能逆轉miR-155的調控效果。這表明miR-155能通過靶向調控TGFBR1和TGFBR2表達抑制Smad信號通路從而調節EndMT。

綜上，miR-155異常低表達可能和AMI密切相關，上調其表達能抑制CFs的增殖和S期阻滯及AMI小鼠的心肌纖維化進程，并且miR-155是通過靶向調控TGFBR1和TGFBR2從而抑制EndMT，可能對AMI誘導的心肌纖維化具有抑制作用。