對比G-CSF及阿托伐他汀干預對毛細血管及腎間質纖維化的影響及其機制

楊曉晶 白海濤 莊良金

(廈門大學附屬第一醫院 1質量管理部，福建 廈門 361003；2兒科)

腎間質纖維化是慢性腎臟疾病發展為終末期腎衰竭的中間過程，既往對腎間質纖維化形成過程的研究主要集中在腎小管上皮細胞凋亡、腎間質炎細胞浸潤，纖維化因子釋放、細胞外基質的生成增多等方面〔1,2〕，而缺乏對腎小管周圍毛細血管的研究。研究顯示，多種慢性腎臟病伴有不同程度的腎小管周圍毛細血管丟失，提示腎小管周圍毛細血管的丟失可能是腎間質纖維化的重要因素之一〔3,4〕。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)〔5〕和他汀類藥物〔6〕均為有效的干細胞動員劑，能動員骨髓內皮祖細胞，提高外周血內皮祖細胞數量。G-CSF是臨床經典的干細胞動員劑，其安全性和有效性已被臨床所證實〔7，8〕。本研究探討G-CSF和阿托伐他汀干預對毛細血管和腎間質纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1試驗動物 選取雄性SD大鼠160只，6周齡，體重200～220 g，購自河北醫科大學動物實驗中心，適應性喂養1 w，隨機分為假手術組、模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組，每組40只，分別于造模后1、2、3和4 w隨機抽取處死10只大鼠進行研究。

1.2實驗方法

1.2.1造模及干預 ①假手術組：僅經右下腹切口，分離右側輸尿管，不結扎。②模型組：經右下腹切口，分離右側輸尿管，在腎輸尿管移行處分兩處結扎輸尿管，然后從中間剪斷輸尿管，模型組及假手術組每天給予生理鹽水 1 ml 灌胃。③G-CSF 組：結扎右側輸尿管并皮下注射 G-CSF 50 μg/(kg·d)。④阿托伐他汀組：結扎右側輸尿管并阿托伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃給藥。飼養于隔離環境中，普通喂養，食物和水經消毒處理，每日12 h光照，溫度 23～26℃、濕度 50%～60%。造模后1、2、3和4 w將以上小鼠頸椎脫臼處死固定在固定平板上，打開腹腔，剪取右側腎臟，放入生理鹽水中漂洗以去除血跡和游離脂肪組織等。迅速放入 10%甲醛溶液中固定。

1.2.2腎臟組織Masson染色法 制作常規石蠟切片，進行脫水、脫蠟等步驟，于麗春紅染液、2%冰醋酸、5%磷鉬酸水溶液中分別染色2 min，再于甲基綠中染色3 min，用清水沖洗。然后進行梯度酒精脫水、二甲苯透明等過程，最后用中性樹膠密封，在高功率(×200)下，選擇15個沒有腎小球和血管的腎皮質視野。以膠原纖維陽性染色程度對腎間質纖維化進行評分：0分：正常；1分：染色面積≤25%；2分：染色面積26%～50%；3分，染色面積51%～75%；4分，染色面積>75%。

1.2.3CD34+細胞免疫組化染色法 使用免疫組織化學染色對石蠟切片進行抗原修復，加入一抗并在4℃條件下孵育，二抗則在37℃條件下孵育30 min，并使用二氨基聯苯胺(DAB)底物顯色。微血管內皮細胞中CD34+在顯微鏡下顯示棕褐色。任何一個棕褐色的內皮細胞或內皮細胞簇作為一條微血管，分支結構也作為一條血管計數(除外大血管)，在顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數陽性的毛細血管腔個數，得出PTC密度(個/mm2)取平均值。

1.2.4細胞間黏附分子(ICAM)-1、結締組織生長因子(CTGF)免疫組化染色法 組織石蠟切片按照SP法試劑盒(福州麥新生物技術有限公司)的說明書進行操作。山羊抗大鼠CTGF和ICAM-1多克隆抗體，在室溫下孵育1 h，洗滌3次，再加入兔抗山羊單克隆抗體(北京雅發生物制品有限公司)，在室溫下孵育15 min，DAB顯色 2～5 min，蘇木素復染，脫水封片，腎組織CTGF和ICAM-1 的免疫組織化學半定量分析采用HPIAS2000型圖像分析軟件(同濟千屏影像工程公司研制)，分析方法為每個標本在放大200倍圖像的腎皮質區依次選取 40個視野，染色陽性部位的深淺及范圍以平均光密度表示。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1各組腎小管周圍毛細血管密度比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎小管周圍毛細血管密度顯著低于假手術組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎小管周圍毛細血管密度顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。免疫組化染色棕褐色為CD34陽性細胞，假手術組PTC密度豐富，分布均勻，形態大致規則。模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組PTC病變呈局灶性分布且PTC密度降低，模型組明顯低于G-CSF組和阿托伐他汀組。見圖1。

2.2各組腎間質纖維化評分比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后1 w、2 w、3 w和4 w腎間質纖維化評分顯著高于假手術組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質纖維化評分顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。Masson染色可將腎小球間質膠原纖維、網狀纖維染成藍色，藍染范圍越多，顏色越深，則表明腎間質纖維化越嚴重。假手術組腎組織形態正常，模型組和G-CSF組、阿托伐他汀組可見腎小管擴張，腎間質纖維化，間質藍染明顯增多，模型組明顯多于G-CSF組、阿托伐他汀組。見圖2。

2.3各組腎間質ICAM-1、CTGF表達比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質ICAM-1、CTGF表達光密度值顯著高于假手術組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質ICAM-1、CTGF表達光密度值顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表1 各組造模不同時間腎小管周圍毛細血管密度及腎間質纖維化評分比較

圖1 各組造模后4 w腎臟病理切片CD34+(免疫組化染色，×100)

圖2 各組造模后4 w腎臟病理切片(Masson染色，×200)

表2 各組造模不同時間腎間質ICAM-1、CTGF表達光密度值比較

3 討 論

腎小管間質纖維化是由多種病因引起的慢性腎臟疾病發展為終末期腎臟疾病的最后一條途徑。腎功能的惡化在很大程度上取決于腎小管間質纖維化程度〔9〕。腎小管周圍毛細血管主要由內皮細胞和基底膜構成，其間散在扁而有突起的周細胞。內皮細胞損傷和功能障礙是腎小管周圍毛細血管丟失的主要原因。研究顯示維持內皮細胞的正常生理功能對毛細血管的結構和功能完整起重要作用，骨髓來源的內皮祖細胞能通過自身分裂增殖、分化為內皮細胞及旁分泌效應參與血管修復及新生〔10〕。

G-CSF是臨床經典的干細胞動員劑，其安全性和有效性已被臨床所證實〔11〕。他汀類藥物是膽固醇合成中的限速酶，能夠抑制肝臟膽固醇生成途徑來減少脂質合成。國內外諸多研究表明〔12〕，他汀類藥物具有降脂作用、促新生血管生成、抗心律失常、動員內皮祖細胞等作用。有研究〔13〕顯示阿托伐他汀能夠明顯增加內皮祖細胞集落形成數目。

作為一種跨膜糖蛋白，CD34在毛細血管和小血管內皮細胞中的表達維持穩定狀態是反映血管內皮細胞狀態的標記物〔14〕。CD34數量能夠反映腎小管周圍的毛細血管密度，本研究中，內皮細胞用CD34染色標記被染成棕黃色。G-CSF動員了內皮祖細胞進而加速了血管新生過程。有研究顯示：干細胞因子能夠動員干細胞歸巢，有助于減少腎小管周圍毛細血管丟失。內皮祖細胞能夠通過自身的分化增殖促進新生血管的生成；還可以通過旁分泌效應使血管內皮細胞發生增殖。阿托伐他汀為3-羥-3-甲基戊二酰輔酶 A還原酶抑制劑，其能促進受損冠狀動脈和外周小動脈內皮化，他汀類藥物的這一效應不依賴它的降膽固醇效應，他汀類藥物促進血管新生可能是通過動員內皮祖細胞，并促進內皮祖細胞的增殖和分化。也可能是G-CSF和阿托伐他激活了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路，該通路調節下游靶標因子并抑制內皮祖細胞凋亡，誘導內皮祖細胞增殖分化。

CTGF可促進細胞增殖，加速細胞外基質的生成，其在腎小球和腎小管周圍表達〔15,16〕。黏附分子是一類糖蛋白，可介導細胞和細胞外基質黏附。 ICAM-1是跨膜單鏈糖蛋白，屬于免疫球蛋白中的一種，其在內皮細胞中的表達能力最強〔17,18〕。腎組織單核細胞，特別是淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤，可對腎小管造成損害并引起間質成纖維細胞活化，最終導致腎小管間質纖維化。

G-CSF 和阿托伐他汀具有廣泛的生物效應，有相似的生物活性，如動員骨髓內皮祖細胞，還能動員造血干細胞、中性粒細胞、單核細胞等，炎癥細胞浸潤可加劇微血管損傷及間質纖維化，集落刺激因子的炎癥細胞動員作用是否會減弱其促進組織修復作用，目前尚缺乏進一步的研究。阿托伐他汀具有多種腎保護功能，除了降低血漿膽固醇外，它還可以改善內皮功能，抑制炎癥反應和抗氧化活性，并可減少內皮細胞凋亡〔19〕，提高內皮一氧化氮合酶生物活性，調節促凝血活性和血小板功能，可促進微血管修復。

腎間質纖維化的發病機制還不是很明確。本研究從腎小管周圍毛細血管密度的丟失和腎間質纖維化的進程方面探討了他汀類藥物及G-CSF的作用，將對臨床改善腎小管周圍毛細血管密度丟失和腎間質纖維提供理論依據。

綜上， G-CSF及阿托伐他汀均能延緩單側輸尿管梗阻大鼠腎小管周圍毛細血管密度丟失和腎間質纖維化進展，兩者作用機制可能相同。