海洋來源真菌Penicillium citrinum的化學成分及其活性研究*

楊素梅，楊曦亮**，肖紹羽佳，周夢蝶，張亞妮，吳兆圓，劉 芳，劉曼麗，方 偉**

(1.武漢科技大學醫學院藥學系，湖北武漢 430065；2.湖北省農業科學研究院，湖北省生物農藥工程研究中心，湖北武漢 430064)

海洋微生物是海洋天然產物的主要來源，海洋來源的真菌逐漸成為發現活性代謝產物的重要目標之一，具有潛在的治療應用前景。其中絲狀真菌因其龐大的元基因組和復雜的遺傳背景，成為具有生物活性天然產物的重要來源[1]。與陸生真菌相比，海洋真菌在高壓、低溫、有限光照和缺乏營養的極端海洋環境中可以產生更多新的次生代謝產物。近年來，已經陸續從海洋來源青霉屬(Pencillium)真菌中分離出結構新穎且活性良好的次生代謝產物，具有抑制酶活性[2]、抑菌[3]、抑制氧自由基[4]等功效。因此，青霉菌在藥物開發中起著至關重要的作用。

橘青霉(Penicilliumcitrinum)是一種具有廣譜抗菌活性的真菌，其粗提物對人類致病菌嗜水氣單胞桿菌(Aeromonashydrophila)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)和白色念珠菌(Candidaalbicans)均有抑制作用[5,6]，為產生具有生物活性的化合物提供了新的思路。橘青霉次生代謝產物中的橘霉素二聚體衍生物penicitol D和1-epi-citrinin H1具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性[7]，penicitrinone A對乳腺癌細胞MCF-7具有細胞毒作用[8]，能抑制黑色素瘤細胞A-375增殖和轉移[9]，且具有抑制乳腺癌細胞遷移和增殖的作用[10]。

此前，本課題組已從海藻內生真菌PenicilliumcitrinumSCSIO41402中發現了兩個新的化合物Sorbicillfurans A和Sorbicillfurans B，這兩個化合物是含雙環[2.2.2]辛烷和四氫呋喃結構的山梨素加合物，其中Sorbicillfurans B對人白血病細胞系HL-60有細胞毒作用[11]。為進一步研究該菌株的活性次生代謝產物，本研究對其進行擴大發酵培養及運用色譜、光譜技術對發酵液的乙酸乙酯提取物進行分離純化，并對所獲單體化合物進行抗神經炎癥活性、抗菌活性和細胞毒活性測試，從中篩選出活性成分，旨在發現新穎的活性天然產物，為天然產物的研究和開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

腔節藻屬(Coelarthroum)海藻采集于南海永興島(16°50′ N，112°20′ E)的珊瑚礁，從中分離得到真菌菌株SCSIO41402，根據菌株的形態特征和ITS序列區域，將其鑒定為Penicilliumcitrinum，該信息已保存于GenBank數據庫中，登錄號為MK988578。該菌株在MB瓊脂培養基(麥芽提取物15 g，人造海鹽24.4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH值7.4-7.8)斜面上4℃保存，存放于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室。

1.1.2 試劑

RPMI-1640(Hyclone，SH30809.01B)；DMEM培養基(Hyclone，SH30243.01B)；胎牛血清(Hyclone；SH30084.03)；PBS(Life，C10010500BT)；MTT(Sigma，M5655-1G)；LPS(Sigma，L2630-10 mg)；Donepezil(MCE，HY-14566)；Sunfire C18 OBD色譜柱(美國Waters公司)；柱色譜用硅膠(200-300目，青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞士)；制備級乙腈(湖北弗頓生化科技有限公司)；LC-MS級乙腈和甲醇(美國飛世爾科學世界公司)；其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3 儀器與設備

Centrifuge離心機(德國Eppendorf公司)；HGC-36A氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司)；Rotavapor R-200旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；Bruker AVANCE核磁共振儀(德國Brucker BioSpin公司)；Waters 2695超高壓液質聯用色譜儀(美國Waters公司)；Waters 2767制備型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；MicroBeta2全功能微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)；Neofuge 15R冷凍離心機[力新儀器(上海)有限公司]；HF160W水套式CO2培養箱[力新儀器(上海)有限公司]；IX71倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 發酵與提取

從PDA培養基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)斜面挑取菌株PenicilliumcitrinumSCSIO41402，接種于100 mL PDB培養基(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L)，置于恒溫搖床上150 r/min、28℃振蕩培養2 d，按照5%的接種量轉接于發酵培養基(麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，瓊脂0.3 g/L)，28℃靜置培養7 d發酵。發酵液中加入等體積的乙酸乙酯進行萃取，提取液40℃減壓濃縮，濃縮后獲得提取物(2.8 g)。

1.2.2 分離與純化

粗提物經葡聚糖凝膠LH-20柱層析分離，用100%甲醇洗脫，合并相同部分得到6個組分(Fr.A-F)。將Fr.F溶于甲醇后，通過制備型高效液相色譜HPLC以24 mL/min的流速，乙腈-0.2%乙酸水(10%-50%-100%)梯度洗脫得到化合物1(1.2 mg)。Fr.C經正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯體積比(10∶1，5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，0∶1)梯度洗脫得到8個組分(sFr.C1-C8)。sFr.C1通過制備型HPLC，經OBD柱以乙腈-水(25%-100%)洗脫得到化合物2(6.22 mg)；sFr.C7通過制備型HPLC，經OBD柱以乙腈-水(10%-100%)梯度洗脫分離化合物3(1.19 mg)；sFr.C2通過制備型HPLC，經OBD柱以乙腈-水(25%-100%)梯度洗脫得到化合物4(4.93 mg)；sFr.C4用制備型HPLC，經C18柱以乙腈-水(20%-100%)洗脫分離得到化合物5(2.2 mg)；sFr.C8通過制備型HPLC，經OBD柱以乙腈-水(20%-80%)溶劑梯度洗脫得到化合物6(1.18 mg)和化合物7(1.85 mg)。

1.2.3 活性篩選

(1)抗神經炎癥活性。

體外培養BV-2小膠質細胞，建立脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的神經炎癥細胞模型。實驗組以化合物濃度分別為3 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL給藥處理，以20 μg/mL多奈哌齊作陽性對照，采用噻唑藍(MTT)法[12]檢測細胞存活率。將BV-2細胞懸液以1×104個/mL的密度接種于96孔板，于37℃培養箱中培養。待細胞貼壁，每孔加入200 μL不同濃度樣品預處理4 h，然后加入2 μg/mL LPS處理24 h，再加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液處理4 h，于37℃培養箱中培養，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min至結晶完全溶解后，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度值(OD值)。

(2)抗菌活性。

化合物在96孔滅菌板上進行抗菌實驗，并用微孔稀釋法[13]測定最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。將受試化合物溶解于DMSO中，采用二倍串聯稀釋法將化合物稀釋到指定濃度，DMSO的最終濃度不超過5%。病原菌包括動物病原細菌(綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、豬丹毒桿菌Erysipelassuis和豬鏈球菌Streptococcussuis)和植物病原真菌(灰霉菌Botrytiscinerea、小麥穎枯病菌Septorianodorum、小麥葉枯病菌S.tritici、棉花黃萎病菌Verticiliumdahliae)。抑菌活性測定以接種培養液和DMSO作為陰性對照，鏈霉素和頭孢匹羅作為陽性對照。真菌于28℃培養48 h，細菌于37℃培養24 h，觀察病原菌的生長狀況。

(3)細胞毒活性。

采用MTT法測定化合物1-7對非洲綠猴胚胎腎細胞Marc-145細胞的抗增殖活性，以5-氟尿嘧啶作陽性對照[12]。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1：黃色油狀(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C19H18N2O2。1H-NMR(700 MHz，CD3OD)δ：7.56(2H，ddt，J=7.6，6.46，0.98，H-4，4′)，7.30(3H，m，H-7，5′，7′)，7.15(1H，s，H-5)，7.03(2H，m，H-6,6′)，6.91(2H，m，H-2，2′)，4.70(1H，d，J=6.7，H-1″)，4.49(1H，td，J=7.0，4.04，H-2″),3.62(1H，dd，J=11.2，4.2，H-3″)，3.49(1H，dd，J=11.2，7.0，H-3′)；13C-NMR(175 MHz，CD3OD)δ：124.1(C-2)，118.0(C-3)，129.3(C-3a)，119.4(C-4)，122.1(C-5)，120.2(C-6)，112.1(C-7)，138.1(C-7a)，123.9(C-2′)，116.5(C-3′)，128.4(C-3′a)，119.3(C-4′)，122.0(C-5′)，120.0(C-6′)，138.0(C-7′a)，38.1(C-1″)，76.4(C-2″)，66.4(C-3″)。以上核磁數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物1為3,3-二吲哚烷基-1,2-丙二醇。

化合物2：淡黃色無定形固體(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C10H12O3。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：1.85(3H，d，J=7.0，H-1)，6.62(1H，m，H-2)，6.12(1H，d，J=2.0，H-5)，5.56(1H，d，J=2.0，H-6)，1.87(3H，s，H-9)，3.86(3H，s，H-10)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：14.3(C-1)，131.0(C-2)，128.3(C-3)，162.7(C-4)，98.9(C-5)，88.6(C-6)，167.0(C-7)，174.1(C-8)，12.1(C-9)，57.0(C-10)。以上核磁數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物2為robillafuran。

化合物3：白色粉末(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C10H12O4。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：4.31(2H，d，J=6.0，H-1)，6.59(1H，td，J=6.0，0.5，H-2)，6.21(1H，d，J=2.0，H-5)，5.60(1H，d，J=2.0，H-6)，1.89(3H，d，J=1.0，H-9)，3.86(3H，s，H-10)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：59.6(C-1)，135.0(C-2)，128.1(C-3)，161.9(C-4)，100.0(C-5)，89.2(C-6)，166.6(C-7)，173.8(C-8)，12.5(C-9)，57.0(C-10)。以上核磁數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物3為asperfuran A。

化合物4：白色固體(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C12H14O4。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：4.54(1H，m，H-3)，2.93(1H，m，H-4)，6.88(1H，d，J=7.0，H-5)，7.61(1H，d，J=7.0，H-6)，1.41(3H，d，J=6.5，H-9)，1.34(3H，d，J=7.0，H-10),4.64(2H，s，H-11)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.0(C-1)，82.7(C-3)，38.4(C-4)，144.6(C-4a)，117.8(C-5)，136.0(C-6)，129.3(C-7)，160.5(C-8)，108.0(C-8a)，19.9(C-9)，18.0(C-10)，59.4(C-11)。以上核磁數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物4為gamahorin。

化合物5：無色晶體(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C11H12O4。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.23(2H，s，H-2)，2.13(3H，s，4-CH3)，3.75(3H，s，5-OCH3)，2.16(3H，s，6-CH3)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：173.9(C-1)，70.8(C-3)，146.2(C-3a)，117.5(C-4)，155.0(C-5)，119.8(C-6)，165.0(C-7)，107.5(C-7a)，11.2(4-CH3)，60.3(5-OCH3)，8.9(6-CH3)。以上核磁數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物5為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基-異苯并呋喃酮。

化合物6：黃色油狀(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C17H22O8。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.53(1H，d，J=2.0，H-1′)，5.23(2H，d，J=6.0，H-2)，4.47(1H，dd，J=3.5，2.0，H-2′)，3.98(1H，m，H-5′)，3.87(1H，dd，J=10.0，3.5，H-3′)，3.78(3H，s，5-OCH3)，3.48(1H，t，J=9.5，H-4′)，2.27(3H，s，6-CH3)，2.20(3H，s，4-CH3)，1.22(3H，d，J=6.0,H-6′)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.3(C-1)，69.8(C-3)，148.6(C-3a)，122.2(C-4)，164.4(C-5)，126.6(C-6)，154.9(C-7)，113.2(C-7a)，106.4(C-1′)，72.0(C-2′)，72.3(C-3′)，73.4(C-4′)，72.2(C-5′)，18.0(C-6′)，11.3(4-CH3)，60.9(5-OCH3)，10.6(6-CH3)。以上核磁數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物6為5-甲氧基-4,6-二甲基-7-氧-α-L-鼠李糖基-異苯并呋喃酮。

化合物7：無色油狀(CH3OH)，結合1H-NMR和13C-NMR數據推測分子式為C21H30O4。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：4.24(1H，d，J=2.0，H-1)，3.95(1H，m，H-2)，3.93(1H，m，H-3)，4.34(1H，dd，J=4.5，2.0，H-4)，6.07(1H，d，J=4.5，H-5)，2.23(2H，m，H-4′)，2.28(2H，m，H-5′)，5.17(1H，m，H-6′)，2.02(2H，t，J=7.0，C-8′)，2.11(2H，q，J=7.0，H-9′)，5.13(1H，m，H-10′)，5.34(1H，d，J=2.0，H-12′)，5.29(1H，d，J=2.0，H-12′),1.70(3H，s，H-13′)，1.66(3H，s，H-14′)，1.63(3H，s，H-15′)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：70.2(C-1)，70.9(C-2)，70.5(C-3)，67.8(C-4)，136.3(C-5)，126.1(C-6)，89.5(C-1′)，90.0(C-2′)，132.9(C-3′)，38.5(C-4′)，27.7(C-5′)，124.5(C-6′)，136.9(C-7′)，40.9(C-8′)，27.7(C-9′)，125.4(C-10′)，132.1(C-11′)，121.8(C-12′)，16.2(C-13′)，25.9(C-14′)，17.7(C-15′)。以上核磁數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物7為pestynol。

化合物1-7的結構如圖1所示。

圖1 化合物 1-7的結構

2.2 活性篩選結果

2.2.1 抗神經炎癥活性

由圖2可知，與空白對照組相比，LPS造模組細胞存活率顯著降低(P<0.001)，平均存活率為52.23%，證明LPS模型造模成功。與LPS造模組

Compared with the blank control group,###P<0.001;compared with the LPS group,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05

相比，各給藥組對BV-2細胞損傷均有明顯的抑制作用。化合物2在3 μg/mL、6 μg/mL和12 μg/mL濃度下BV-2細胞的存活率分別為62.84%、69.44%和76.77%；化合物4在3 μg/mL、6 μg/mL和12 μg/mL濃度下BV-2細胞的存活率分別為59.89%、65.42%和69.69%，以上結果均具有統計學意義。綜上所述，在一定的濃度范圍內，藥物濃度與抗神經炎作用具有一定的量效關系，其中化合物2在12 μg/mL濃度下對LPS損傷的BV-2細胞抑制作用最顯著(P<0.001)，與陽性對照組活性接近。

2.2.2 抗菌活性

由表1可知，化合物7對金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌和豬鏈球菌顯示弱的抑制活性，MIC值均為100 μg/mL；對植物病原真菌灰霉菌以及小麥穎枯病菌具有中等的抑制活性，MIC值均為50 μg/mL。

2.2.3 細胞毒活性

化合物1和7對Marc-145細胞表現出一定的細胞毒活性，其LC50值分別為57.397 μg/mL和35.386 μg/mL，其中化合物7的活性相對最強，與陽性對照藥5-氟尿嘧啶(28.281 μg/mL)的效果最為接近。化合物2-6對Marc-145細胞的LC50都大于80 μg/mL。

表1 化合物的抗菌活性結果

3 討論

海洋環境的高壓、高鹽、低溫和營養稀缺等特點決定了海洋真菌獨特的代謝機制和適應機制，可以產生結構新穎和良好藥理活性的天然產物。青霉屬真菌是海洋真菌中研究較多的真菌之一，也是重要的藥物產生菌。

本研究結果顯示，化合物1-7均為首次從青霉屬真菌中分離得到。化合物7對5種病原菌(金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌、灰霉菌以及小麥穎枯病菌)具有一定的抑制活性。據報道，化合物7對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae)有微弱的生長抑制作用，且對Jurakat、HL60、THP-1、HT29和A549細胞具有微弱的細胞毒活性[20]。此外，也有文獻報道，化合物1對大腸桿菌和污垢分歧桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)有抑制活性[14]，具有98.6%的鹵蟲致死率[21]。化合物1和7具有研發抗菌藥物的潛力。

在抗腫瘤方面，化合物1和7對Marc-145細胞顯示細胞毒活性，其中化合物7的活性相對最強，與5-氟尿嘧啶藥效接近，具有進一步篩選成為抗腫瘤藥物的潛力。研究表明，化合物2-6對Marc-145細胞顯示較弱的抗腫瘤活性。但也有文獻報道，化合物5對HeLa腫瘤細胞有明顯的抑制作用，其48 h的半抑制濃度(Median Inhibitory Concentration，IC50)值為7.8 μmol/mL，而化合物6對HeLa腫瘤細胞無抑制活性[22]。從結構上來看，化合物5為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基-異苯并呋喃酮，化合物6為5-甲氧基-4,6-二甲基-7-氧-α-L-鼠李糖基-異苯并呋喃酮，化合物6為化合物5的7-O鼠李糖苷，其構效關系值得后續深入研究。

在神經炎癥活性方面，發現化合物2和4具有良好的抑制神經炎癥活性的作用，這兩個化合物活性篩選研究很少，只有化合物2對小鼠ST-13脂肪細胞的誘導分化作用[15]以及化合物4的抗菌活性有少量研究[23]。化合物4為異香豆素類天然產物。有研究表明，異香豆素化合物在一定的濃度范圍內能顯著地保護由H2O2誘導引起的SH-SY5Y細胞損傷，并具有良好的劑量依賴性[24]。因此，后續工作將進一步研究化合物對細胞內炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β (IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)以及一氧化氮(NO)的釋放情況，并在計算機虛擬篩選技術指導下，觀察NF-κB/p65的磷酸化水平以及iNOS的表達。

4 結論

橘青霉的次生代謝產物種類豐富，且具有廣泛的生物活性。從菌株Penicilliumcitrinum的發酵液中共分離得到7個已知化合物，均為首次從青霉屬中分離得到，其中3,3-二吲哚烷基-1,2-丙二醇(1)為首次從真菌中分離得到。活性篩選結果表明，robillafuran (2)和gamahorin (4)具有良好的抑制神經炎癥活性；3,3-二吲哚烷基-1,2-丙二醇(1)和pestynol (7)對Marc-145細胞具有細胞毒活性，LC50值分別為57.397 μg/mL和35.386 μg/mL；且pestynol (7)具有抗革蘭氏陽性菌和植物病原菌活性。以上結果豐富了海洋來源Penicilliumcitrinum的藥效物質基礎，為發掘新型神經保護藥物、抗菌藥物及天然活性產物提供了參考依據。