疏肝溫膽湯對機動車尾氣誘導大鼠血管內皮損傷的作用

趙帥 陳燕虹 莊杰欽 高煥佳 蔡海榮 陳伯鈞

(廣州中醫藥大學 1第二附屬醫院，廣東 廣州 510120；2第二臨床醫學院)

現今，我國霧霾天氣日益嚴峻，不僅影響了生態環境，還對人體的健康造成了威脅〔1～3〕。而PM2.5(顆粒物粒徑動態直徑<2.5 μm)作為霧霾天氣的罪魁禍首〔4〕，其主要來源有燃煤、機動車尾氣排放、工業生成過程及其他排放源(地面揚塵、溶劑揮發、植物、農業及生物質的燃燒等)〔5〕。長期暴露于PM2.5環境中會導致血管內皮功能受損從而加速動脈粥樣硬化(AS)的發展〔6〕。內皮功能的損傷與AS的發病機制息息相關，內皮受損可使平滑肌細胞增生、脂質沉積、白細胞黏附、粥樣斑塊脆性增多與破裂，引起血栓形成，是引發心血管疾病共同的生理病理基礎，引起AS形成的關鍵。因此，對內皮功能的紊亂采取干預措施，已然是防治AS的緊要環節。

炎癥反應是引起血管內皮功能損傷的重要機制，而核轉錄因子(NF)-κB信號通路在炎癥中起著極其重要的作用，其下游主要因子為腫瘤壞死因子(TNF)-α。肝X受體(LXR)α具有調節脂質代謝及炎癥反應的作用，還可以影響TNF因子。本研究以吸入機動車尾氣作為暴露于霧霾的一種手段，通過制備相關空氣污染的動物模型，以炎癥通路為干預靶點，探討疏肝溫膽湯對動脈血管內皮損傷的影響及可能機制，為中醫藥治療血管內皮損傷提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 LXRα、TNF-α、NF-κB用Primer Premier5軟件設計；戊二醛磷酸緩沖液；全自動生化分析儀；Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P；JEM-2000EX型透射電鏡；離心機等均由廣州醫科大學實驗室提供。

1.2動物 從廣東省醫學實驗動物中心購入雄性健康成年SD大鼠20只，體重約130 g，許可證號：SCXK(粵)2013-002，生產批號：44007200038004。

1.3實驗藥物的制備 疏肝溫膽湯(陳皮15 g、竹茹12 g、半夏10 g、枳實15 g、甘草6 g、茯苓20 g、柴胡12 g、白芍15 g、丹參15 g)，藥物批號：161102201，以上藥材均由廣東省中醫院中藥房提供，按成年人60 kg體重劑量的4倍水煎濃縮至含生藥1.24 g/ml，高壓滅菌，4℃冰箱保存備用。

1.4暴露及干預方式 將暴露組和藥物組置于機車尾氣暴露房，關閉暴露房，打開機車開關，擰動引擎5 min，后關閉開關，打開暴露房內的小電扇使暴露均勻，如此暴露6 h后搬出動物，藥物組用疏肝溫膽湯按照1 ml/100 g的比例進行灌胃。如此暴露及干預2個月。對照組飼養于實驗室過濾空氣環境。

1.5C反應蛋白(CRP)水平測定 于2個月干預結束時，動脈采血5 ml，以4℃ 3 000 r/min離心15 min后取上層血清，用生化分析儀檢測CRP水平。

1.6組織病理學觀察 采血結束后，立即開胸取主動脈約2 cm，用戊二醛磷酸緩沖液固定，不超出3 d，經磷酸緩沖液沖洗，用1%鋨酸加0.8%鐵氰化鉀固定，再經磷酸緩沖液漂洗，行梯度丙酮脫水，包埋，聚合。先制成半薄切片，用光鏡觀察定位于血管內膜部位。然后切成70～80 nm的超薄切片，置于附有支持膜的銅網上，用5%的水性醋酸鈾染色，再用枸櫞酸染色5 min后用透射電鏡觀察并拍照。

1.7采用RT-PCR檢測肝臟組織內LXRα、TNF-α、NF-κB的mRNA表達水平 收集肝臟組織，提取組織RNA，紫外分光光度計測定組織RNA分別在280nm和260nm處的吸光度值(OD)，并計算RNA的含量及純度。從組織總RNA逆轉錄合成總cDNA，然后稀釋探針及引物，依次加入每管中，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P 94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃ 20 s，40個循環，記錄結果。檢測基因的序列、產物長度見表1。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析、秩和檢驗、χ2檢驗、多因素重復測量方差分析。

表1 PCR 引物序列及產物片段長度

2 結 果

2.1藥物對LXRa、TNF-α、NF-κB的mRNA表達水平的影響 暴露組肝臟LXRa mRNA水平較對照組顯著下降，肝臟內NF-κB、TNF-α mRNA水平較對照組顯著升高(P<0.05)。藥物組肝臟LXRα mRNA水平較暴露組顯著升高，肝臟NF-κB、TNFα mRNA水平較暴露組顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、LXR-α、NF-κB mRNA表達

2.2CRP水平 暴露組CRP水平較對照組顯著升高〔(0.48±0.08)mmol/L vs (0.20±0.08)mmol/L〕，而藥物組CRP水平〔(0.27±0.15)mmol/L〕較暴露組顯著下降(均P<0.05)。

2.3組織病理學檢測

2.3.1蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 對照組：血管內皮細胞呈梭形，結構較完整，排列較整齊，大小較一致。暴露組：血管內膜增厚，內皮細胞減少，結構不完整，排列紊亂，中可見較多中性粒細胞(黑色箭頭所指)。藥物組：內膜未見明顯增厚，細胞結構及排列尚規整，未見炎癥細胞。見圖1。

2.3.2掃描電鏡觀察 對照組：內皮完整，內皮細胞呈梭形，排列交錯，細胞間緊密連接。暴露組：內皮細胞收縮，細胞間隙增大，部分內皮細胞脫落，形成脫失區中可見較多泡沫細胞及炎癥細胞(黑色箭頭指代炎癥細胞浸潤，紅色箭頭指代泡沫細胞)。藥物組：內皮尚規整，細胞間連接較疏松，未見細胞間隙開大及內皮細胞崩解。見圖2。

圖1 各組胸主動脈組織病理學(HE染色，×100)

圖2 各組胸主動脈掃描電鏡

3 討 論

血管內皮功能的損傷與AS的發生發展直接相關，內皮損傷已成為心血管病發病的獨立危險因素〔7,8〕。炎癥反應是內皮損傷的主要機制，單核/巨噬細胞激活、滲出、分化和泡沫細胞的形成是AS斑塊典型的特征。目前研究證明，炎癥因子直接參與AS的形成〔9,10〕。hs-CRP可使炎癥細胞向血管內皮遷徙，使單核、淋巴細胞激活，使AS發展〔11〕。可激活NF-κB是促炎癥基因表達的關鍵，NF-κB 通過促使局部炎癥和細胞因子轉錄的增強，使白細胞及黏附因子的表達增加，使中膜平滑肌細胞向內膜遷徙，單核細胞堆積、浸潤，從而導致AS形成〔12〕。在刺激因子的誘導下，NF-κB活化后可調控一些基因的表達，而前炎癥性細胞因子TNF-α是NF-κB通路重要的下游調控因子〔13〕。TNF-α因子能夠誘導白細胞介素(IL)-6、IL-10等炎性細胞的釋放，損傷血管內皮。LXR表達于巨噬細胞，是膽固醇在斑塊中代謝的重要的信號通路〔14〕。研究發現LXR不僅參與調節膽固醇的逆轉運，而且在炎癥調控方面起關鍵作用。LXR具有抗炎的作用，可以通過對炎癥因子表達的調控，參與機體炎癥反應的調節〔15,16〕。巨噬細胞在炎癥及免疫反應中起到至關重要的作用，能被內毒素通過 Toll 樣受體(TLR)4通路激活釋放炎癥介質，其中內毒素主要為革蘭陰性桿菌細胞壁中的脂多糖(LPS)成分。在人體中，LXR可以增加TLR4的表達，并增強TLR4對LPS的反應性〔17〕。而且LXR的激活對經由TLR4通路增強的免疫炎癥反應起著允許作用〔18〕。有研究提及 LXRs 的激動劑能壓制一些炎癥因子表達，其中包括：TNF-α、CRP等〔19〕。LXR 激動劑作用于人單核巨噬細胞，可抑制TNF-α在核酸和蛋白質水平上的表達，起到保護血管內皮功能的作用〔19〕。LXR具有調節體內生理活動和基因的作用〔20〕，目前已知LXR有兩種同源亞型:LXRα和LXRβ，其中LXRα是一種核受體〔21〕，在與脂代謝緊密相關的組織如肺、脂肪組織、小腸、腎上腺、腎和巨噬細胞中高度表達，但在肝中含量最豐富。本研究結果說明疏肝溫膽湯在抑制炎癥方面發揮顯著療效。

疏肝溫膽湯是陳伯鈞教授治療AS的經驗方，由溫膽湯和柴胡疏肝散化裁而成，全方共七味藥物，具有化痰祛瘀、疏肝理氣的功效。疏肝溫膽湯可以使AS患者的癥狀得到改善。前期實驗研究表明疏肝溫膽湯能夠使血脂水平降低，AS斑塊面積縮小、動脈硬化程度減輕，且已證實疏肝溫膽湯可以使LXRα的表達上調。疏肝溫膽湯中柴胡疏肝解郁以理氣和肝膽；芍藥柔肝養陰；竹茹清熱化痰，止嘔除煩；法半夏燥濕降逆以和胃；茯苓健脾滲濕；枳殼、陳皮行氣導滯以疏通氣機；川芎活血化瘀，行氣止痛以通達肝脾；甘草和中緩痛。諸藥共濟，合以法暢。此方以疏肝理氣為主，兼以養肝，調血和胃。臨床上應用疏肝理氣方藥能改善血管內皮功能〔22〕，疏肝的方法也能改善血脂狀況〔23〕，疏肝理氣要藥柴胡有抗炎、抗氧化、穩定細胞膜、抑制血管通透性增加等作用〔24〕。因此，疏肝解郁、調理氣機對于AS的預防及其引發的心腦血管病有多方面的作用機制。

綜上，在對機動車尾氣誘導所致血管內皮損傷的大鼠中，應用疏肝溫膽湯進行干預能取得令人滿意的效果，可以明顯降低機車尾氣對血管內皮造成的影響，改善血管內皮損傷，升高肝臟LXRα水平，降低肝臟NF-κB、TNFα、血清CRP，這為心血管內皮損傷疾病的中醫治療方面提供了一定的思路和理論基礎。但本實驗中樣本量較少，需擴大樣本量以進一步研究。