兩種含醛基的銥配合物用于半胱氨酸和OH-的識別

佟 鑫 趙世盛 楚 曦 李文豪 李紅巖

(河北工業大學化工學院，天津300130)

0 引言

生物硫醇類化合物如半胱氨酸(Cys)、高胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在生物體內起著重要作用[1]，其中Cys對人體內蛋白質的合成以及新陳代謝的正常進行具有重要影響[2-4]。人體內Cys濃度過高可能引發類風濕性關節炎、帕金森病、精神分裂癥和阿爾茨海默病等疾病[5-8]，而Cys缺乏可能導致生長遲緩、頭發脫色、組織水腫、肌肉減少、皮膚和肝臟損傷等相關疾病的出現[9]。因此，對Cys的濃度監測具有重要意義。同時，自然環境如水的pH對維持動植物正常的生命活動具有重要意義[10]。然而，人類生產或生活過程中廢水廢氣等的排放會影響環境pH的變化[11]，即使環境pH的微小變化也會破壞動植物生命系統甚至生態系統的平衡[12]。因此，快速、靈敏地檢測pH對于保護生物和生態環境是非常必要的。

目前，已經開發出一些方法用于檢測Cys的濃度和pH值。如檢測Cys的方法有毛細管電泳法[13]、電位滴定法[14]、高效液相色譜法[15]和質譜法[16]等，而檢測pH的常見方法有電化學[17]、核磁共振波譜[18]和酸堿滴定[19]等方法。隨著光學檢測方法的不斷發展，磷光檢測因為具有較大斯托克斯位移、高化學穩定性和光穩定性以及較長的三重態壽命等優點，在化學傳感中得到了廣泛的應用[20]。相比于其他磷光金屬配合物，Irバ配合物由于具有較高的量子產率、發光顏色可調節以及穩定性好等優點而被認為是最好的磷光傳感材料之一[21-23]。在過去的幾十年中，Irバ配合物被成功地應用于金屬離子[24-25]、氧氣[26]、氨基酸[27-28]和pH[29]等物質的檢測中，并表現出較高的選擇性和靈敏度。如Yu等[30]通過將二甲基吡啶胺基團引入Irバ配合物中實現了對Cu2+的磷光猝滅型檢測。Shiu等[31]報道的銥配合物實現了對Cys的增強型檢測，Mao等[32]合成的銥配合物可以對活體斑馬魚體內的Cys進行有效識別。然而，目前報道的應用于化學傳感領域的銥配合物多數是針對單一分析物的檢測，能夠同時檢測2種或2種以上分析物的磷光銥配合物相對較少。因此，對基于銥配合物的多功能磷光探針的設計和合成具有一定的研究意義。

我們合成了具有[Ir(C^N)2(N^N)]PF6(C^N為環金屬配體，N^N為中性配體)結構的2種銥配合物[Ir(L1)2(dbr-bpy)]PF6(Ir1)和[Ir(L2)2(dbr-bpy)]PF6(Ir2)(L1=6-苯基煙醛，L2=6-(4-三氟甲基苯基)吡啶-3-甲醛，dbr-bpy=4，4′-二溴-2，2′-聯吡啶)。對這2個銥配合物的光物理性質和電化學性質進行了測定和討論，研究了它們對Cys和OH-的雙向檢測性能。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

主要試劑有苯硼酸(AR，購自阿拉丁試劑有限公司)、4-三氟甲基苯硼酸(AR，上海皓鴻生物醫藥科技有限公司)、6-溴-3-甲醛吡啶(AR，北京百靈威有限公司)、四(三苯基膦)鈀(AR，陜西開達化工有限公司)、IrCl3·nH2O(wIr≥54%，昆明鉑銳金屬材料有限公司)、dbr-bpy(AR，北京伊諾凱科技有限公司)、六氟磷酸鉀(AR，阿拉丁試劑有限公司)、2-乙氧基乙醇(AR，北京百靈威科技有限公司)。其他試劑均為市售分析純，沒有經過進一步的提純。

1H和13C NMR采用Bruker AM 400 MHz核磁共振儀完成。質譜通過ESI-MS(Bruker Scientific Instruments LC-MS)質譜儀進行測定。吸收光譜和發射光譜分別在UV-2700紫外可見分光光度計和Hitachi F-2700熒光光譜儀上測得。磷光壽命是在Edinburgh FLS920P光譜儀上測得并經過擬合處理。循環伏安（CV）實驗在CHI 760E電化學工作站上進行，測定時以鉑盤電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag+/Ag為參比電極，使用四丁基六氟磷酸銨(0.10 mol·L-1)為支持電解質，測定過程電壓的掃描速度為0.1 V·s-1。采用Gaussian09軟件包進行理論計算，利用密度泛函理論（DFT）含時密度泛函理論(TD-DFT)對配合物分子結構進行基態結構優化。計算過程中，銥原子采用LANL2DZ贗勢基組，其他原子采用6-31G(d，p)基組。

1.2 配合物的合成

配 體L1、L2和 二 橋 配 合 物[(L1)2Ir(μ-Cl)]2、[(L2)2Ir(μ-Cl)]2按照文獻報道方法合成[33-34]。配合物Ir1和Ir2的合成路線如圖1所示。

圖1 Irバ配合物Ir1和Ir2的合成路線Fig.1 Synthetic routes of Irバcomplexes Ir1 and Ir2

在氮氣氛圍條件下將0.32 g(0.30 mmol)[(L1)2Ir(μ-Cl)]2、0.09 g(0.60 mmol)dbr-bpy溶解在二氯甲烷和甲醇的混合溶液中，50℃下反應5 h，冷卻至室溫，加入0.11 g(0.60 mmol)KPF6，室溫攪拌1 h，除去溶劑后粗產物用硅膠柱層析分離，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(10∶1，V/V)，得0.31 g配合物Ir1，為深紅色固體，產率78%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.81(s，2H)，9.37(d，J=1.9 Hz，2H)，8.46(d，J=8.5 Hz，2H)，8.30(dd，J=8.5，1.7 Hz，2H)，8.14(d，J=1.4 Hz，2H)，8.06～8.00(m，4H)，7.66(d，J=5.9 Hz，2H)，7.08(t，J=8.0 Hz，2H)，6.97(t，J=7.4 Hz，2H)，6.26(d，J=7.4 Hz，2H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ190.68,171.54,156.62,153.21,152.27，151.04，143.13，138.08,136.48,132.68,132.34,131.99，131.46，129.71，127.50,123.49,120.68。IR(KBr，cm-1)：3 109(m),1 691(s)，1 596(s)，1 396(s)，1 220(s)，827(vs)，742(s)，555(s)。MS(ESI)：m/z=870.978 1[M-PF6]+，[C34H22Br2IrN4O2]+理論值870.971 8。

Ir2的合成過程與Ir1相似，將0.45 g(0.30 mmol)[(L2)2Ir(μ-Cl)]2、0.17 g(0.60 mmol)dbr-bpy和0.11 g(0.60 mmol)KPF6反應后得到0.35 g配合物Ir2，為橙黃色固體，產率60%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.86(s，2H)，9.40(s，2H)，8.65(d，J=8.4 Hz,2H)，8.45(d，J=8.4 Hz，2H)，8.33～8.24(m，4H)，8.05～7.99(m，2H)，7.65(d，J=6.0 Hz，2H)，7.43(d，J=8.3 Hz，2H)，6.37(s，2H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ190.69,169.52,156.52,153.77,151.46，147.36，138.73，136.83,132.87,132.46,131.17(q,30 Hz),129.87,127.75，127.19,125.46,122.74,122.10，120.71。IR(KBr，cm-1)：3 120(m),1 697(s),1 599(s),1 481(s),1 402(s)，1 321(vs)，1 136(s)，852(vs)，559(s)。MS(ESI)：m/z=1 006.948 6[M-PF6]+，[C36H20Br2F6IrN4O2]+理論值1 006.946 6。

1.3 Cys的檢測實驗

首先配制濃度為0.50 mmol·L-1的配合物Ir1和Ir2的乙腈溶液，然后配制濃度為0.10 mol·L-1的Cys和其他不同種類氨基酸的水溶液，包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。選擇性實驗是向銥配合物的溶液中分別加入1.0 mmol·L-1的各種氨基酸溶液，然后測試發射光譜的變化。競爭實驗是首先向銥配合物的溶液中分別加入1.0 mmol·L-1的除Cys外的其他氨基酸溶液，測試該混合溶液的發射光譜，然后在上述混合溶液中再分別加入1.0 mmol·L-1的Cys溶液，測試發射光譜的變化。滴定實驗是向銥配合物的溶液中逐步加入Cys溶液，使其濃度為0～2.0 mmol·L-1，然后分別測試發射光譜。所有測試溶液都是混合2 min后進行發射光譜的測試。

1.4 OH-檢測實驗

配制濃度為0.50 mmol·L-1的配合物Ir2的二甲基亞砜(DMSO)溶液作為儲備液，將其在DMSO/H2O(7∶3，V/V)溶液中稀釋至2.5 μmol·L-1作為使用液。然后配制OH-(NaOH)和其他不同種類陰離子的水溶液，包括Cl-、CO32-、HCO3-、SO42-、SO32-、NO2-、Ac-、HCOO-、Br-、PO43-和HSO3-，所用陰離子均為相應的鈉鹽或鉀鹽。選擇性實驗是向Ir2的溶液中分別加入100 mmol·L-1的各種陰離子溶液，然后測試發射光譜的變化。競爭實驗是首先向Ir2的溶液中分別加入除OH-外的其他陰離子溶液，測試混合溶液的發射光譜，然后在上述溶液中再分別加入OH-溶液，測試發射光譜變化。滴定實驗是向Ir2的溶液中逐步加入OH-溶液，使其濃度為0～100 mmol·L-1，然后在熒光光譜儀下進行發射光譜的測試。

2 結果與討論

2.1 配合物的光物理性質

圖2所示是配合物Ir1和Ir2在室溫條件下、乙腈溶液中的紫外可見吸收光譜和發射光譜，相關的數據列于表1中。圖2a表明在250～400 nm范圍內，Ir1和Ir2都出現較強的吸收峰，這些吸收可以歸屬于以配體為中心的自旋允許的π-π*躍遷。在低能量范圍(＞400 nm)的吸收峰可以歸屬于金屬-配體間的電荷轉移躍遷吸收，即MLCT吸收，包括自旋允許的1MLCT和自旋禁阻的3MLCT的混合躍遷吸收[35-37]。在低能量區域，配合物Ir2的吸收峰相比于Ir1的吸收峰藍移了12 nm，這是配合物中環金屬配體結構的不同導致的[38]。銥配合物的最高占據分子軌道(HOMO)主要分布于金屬Irバ和環金屬配體上(表S1，Supporting information)，與Ir1相比，Ir2的環金屬配體上引入了強吸電子的CF3基團，造成配合物Ir2的HOMO能級降低，能隙增大，從而使低能量區域的吸收帶產生藍移。

圖2 配合物Ir1和Ir2在乙腈溶液(20 μmol·L-1)中的UV-Vis吸收光譜(a)和發射光譜(b)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(a)and emission spectra(b)of complexes Ir1 and Ir2 in CH3CN

表1 配合物Ir1和Ir2的光物理和電化學性質Table 1 Photophysical and electrochemical properties of complexes Ir1 and Ir2

圖2b為配合物Ir1和Ir2在室溫條件下乙腈溶液中的發射光譜圖。從圖中可以看出Ir1和Ir2的發射光譜表現出典型的寬峰而且無精細結構。配合物Ir1的最大發射峰位于584 nm，為橙紅光。配合物Ir2的最大發射峰位于530 nm，為黃光。文獻報道的以3-甲基-2-苯基吡啶為環金屬配體、以dbr-bpy為中性配體的銥配合物[39]的發射峰位置為630 nm，和這個配合物相比，將醛基引入銥配合物的環金屬配體后，Ir1的發射峰位置藍移了46 nm。在此基礎上，在環金屬配體的苯環上再引入CF3基團，配合物Ir2的發射峰又藍移了54 nm。這說明在銥配合物的環金屬配體中引入吸電子的醛基和三氟甲基基團后，可以使HOMO能級降低，配合物的能隙差增大，發射光譜藍移。量子效率和壽命是用來衡量磷光材料光物理性質的重要參數，以fac-Ir(ppy)3作為參比物質，利用配合物在乙腈溶液中的紫外可見吸收光譜和發射光譜計算得到了配合物Ir1和Ir2的發光量子效率，分別為49%和66%(表1)。在MLCT激發和最大發射波長處監測，測定了Ir1和Ir2在乙腈溶液中的激發態壽命，分別為1.6和3.3 μs，處于微秒級別。以上結果表明這2種配合物是典型的磷光發光材料。

2.2 電化學性質和理論計算

采用CV法研究了配合物Ir1和Ir2的電化學性能，CV曲線如圖3所示，相關電化學數據列于表1。在陽極氧化過程中，配合物Ir1和Ir2在1.00～1.60 V(vs Ag+/Ag)范圍內均表現出可逆的氧化還原峰，這可以歸因于以金屬為中心的Irバ/Irビ的氧化還原。Ir1和Ir2的氧化電位分別為1.08和1.33 V。和Ir1相比，Ir2的氧化電位正向移動了0.25 V，這表明Ir2的環金屬配體中CF3的引入使HOMO能級降低，配合物更難從HOMO軌道失去電子，故氧化電位增大。

圖3 室溫下配合物Ir1和Ir2在CH2Cl2/CH3CN(1∶1,V/V)溶液中的CV曲線Fig.3 CV curves of complexes Ir1 and Ir2 in CH2Cl2/CH3CN(1∶1,V/V)solution at room temperature

利用DFT和TD-DFT對配合物Ir1和Ir2進行了理論計算，其前線分子軌道的電子云分布圖及相應軌道能級見圖4，HOMO和LUMO(最低未占分子軌道)的構成和主要的電子躍遷位置及性質分別列于表S1～S3。由圖4可見，配合物Ir1和Ir2的LUMO主要分布在中性配體(84.58%～92.66%)上，少量分布于環金屬配體(4.22%～15.43%)和銥原子的d軌道(2.54%～3.12%)上。HOMO主要位于環金屬配體(48.31%～50.00%)和 銥 原 子 的d軌 道(46.34%～48.11%)上，少量位于中性配體(3.58%～3.67%)上，HOMO和LUMO的電子云分布規律和文獻報道的多數銥配合物的前線分子軌道的組成一致[40]。根據理論計算，配合物Ir1和Ir2的LUMO能級非常接近，分別為-3.03和-3.10 eV，這與它們有相同的中性配體有關。配合物Ir1和Ir2的HOMO能級分別為-6.11和-6.38 eV，說明吸電子基團CF3的引入可以有效地穩定HOMO能級，從而擴大HOMO和LUMO之間的能隙差，這與Ir2具有較高的氧化電位一致，也與紫外可見吸收光譜在低能量區的光譜移動規律相吻合。

圖4 DFT方法計算得到的配合物Ir1和Ir2的前線分子軌道圖以及環金屬配體(黑線)、銥原子(紅線)和中性配體(藍線)在分子軌道中的組成比例Fig.4 Frontier molecular orbital diagrams of complexes Ir1 and Ir2 calculated by the DFT method and the composition ratio of cyclometalated ligand(black line),iridium atom(red line),and neutral ligand(blue line)in molecular orbitals

2.3 銥配合物對Cys的檢測性能

對性能優異的磷光傳感材料來說，高選擇性是必要的。為了研究配合物Ir1和Ir2對Cys的檢測性能，在Ir1和Ir2的乙腈溶液(0.5 mmol·L-1)中分別加入1.0 mmol·L-1的氨基酸(Cys、Ala、Arg、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，測定了配合物在不同氨基酸存在下的磷光光譜的響應變化。如圖S7a所示，在Ir1的溶液中加入Cys后，Ir1的光致發光顯著猝滅，發射峰強度降低了近82%，而加入其他氨基酸時，Ir1的發光強度變化很小。從圖S7b可以看出，配合物Ir2也得到類似的結果，加入Cys后發射峰強度降低了近87%。以上結果表明，配合物Ir1和Ir2對Cys具有較高的選擇性，可作為對Cys的猝滅型磷光分子探針。

抗干擾能力對于磷光傳感材料也是十分重要的。通過競爭實驗研究了共存氨基酸(Ala、Arg、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)對Cys測定的影響，結果如圖5所示。在其他競爭性氨基酸存在的條件下，配合物Ir1和Ir2仍然可以實現對Cys的識別，并且受到競爭性氨基酸的影響較小。結果表明，配合物Ir1和Ir2對Cys的檢測具有較強的抗干擾能力。

圖5 在各種氨基酸不存在和存在下配合物Ir1(a)和Ir2(b)的磷光響應Fig.5 Phosphorescence response of complexes Ir1(a)and Ir2(b)in the absence and presence of various amino acids

為了進一步考察配合物Ir1和Ir2對Cys的檢測性能，研究了在配合物Ir1和Ir2的乙腈溶液中逐步加入不同濃度的Cys后的發射光譜，從而分析配合物的發光強度與Cys的濃度之間的線性關系。如圖6a所示，在配合物Ir1的溶液中逐步滴加Cys后，發光強度逐漸減小，直至加入1.0 mmol·L-1的Cys后發光強度保持不變。在Cys濃度為0～1.0 mmol·L-1范圍內，Ir1在584 nm處的發光強度隨Cys濃度的變化曲線呈現良好的線性關系(圖6a插圖)，且Ir1與Cys的結合比約為1∶2。同樣，通過磷光發射光譜的強度變化，進行了Ir2與Cys的滴定實驗，結果如圖6b所示。在Ir2的乙腈溶液中逐漸加入Cys時，Ir2在530 nm處的發光強度不斷降低，直到加入1.0 mmol·L-1的Cys后發光強度基本保持不變。通過公式LOD=3σ/k[41]計算出配合物Ir1和Ir2對Cys進行選擇性識別的檢出限（LOD）分別為35.1和18.5 μmol·L-1，公式中σ為空白測量的標準偏差，k為配合物發光強度隨Cys濃度的變化曲線的斜率。根據文獻[42-43]，配合物Ir1和Ir2選擇性識別Cys可能的機理如圖7所示，Irバ配合物中的醛基可與β-氨基硫醇類化合物反應，生成具有噻唑烷結構的化合物，從而改變銥バ配合物激發態性質，使配合物的發光強度顯著降低。

圖6 在配合物的乙腈溶液中逐漸加入不同濃度Cys后的發射光譜變化Fig.6 Changes in the emission spectra of the complexes in acetonitrile solution with various concentrations of Cys

圖7 配合物Ir1/Ir2與Cys結合的可能機制Fig.7 Possible mechanism of the combination of Ir1/Ir2 with Cys

2.4 配合物Ir2在OH-檢測中的應用

以配合物Ir2為例，研究了銥配合物在OH-檢測中的應用。首先通過時程實驗研究了Ir2對OH-的響應時間，結果如圖S8所示。在加入OH-(100 mmol·L-1)后的360 min內，配合物Ir2的發光強度隨著時間增加而逐漸增強，發射峰位置從550 nm藍移到506 nm，在360～480 min的時間范圍內，配合物的發光強度不再發生明顯變化。因此，配合物Ir2檢測OH-的穩定時間為360 min，以下實驗均采用360 min的反應時間。

為了獲得最佳的傳感性能，我們測試了DMSO/H2O溶劑中不同H2O體積分數下配合物Ir2對OH-的檢測性能，結果如圖8a所示。當DMSO中H2O的含量為30%時，在配合物Ir2的溶液中加入100 mmol·L-1的OH-后，顯示出最高的發射峰強度。和純DMSO溶劑條件下的發射光譜相比，H2O的含量為30%時的光譜發生明顯藍移(14 nm)，發光顏色由黃綠色變為綠色。隨著H2O比例的進一步升高，Ir2的發光強度逐漸減弱，這種現象也可以在紫外光(365 nm)照射下用肉眼觀察到(圖S9)。

圖8 (a)DMSO/H2O溶劑中不同H2O體積分數下，在配合物Ir2的溶液中加入OH-(100 mmol·L-1)后的發射光譜;(b)在配合物Ir2的DMSO/H2O(7∶3,V/V)溶液中，逐漸加入不同濃度OH-后的發射光譜Fig.8(a)Emission spectra of Ir2 with OH-(100 mmol·L-1)added in a system containing different volume fractions of H2O in DMSO;(b)Emission spectra of Ir2 upon the increasing concentration of OH-in DMSO/H2O(7∶3,V/V)

在優化溶劑條件后，進一步研究了配合物Ir2在DMSO/H2O(7∶3，V/V)中對不同濃度OH-的檢測效果，結果如圖8b所示。在配合物Ir2的溶液中逐漸加入不同濃度的OH-(0～100 mmol·L-1)后，配合物的發射峰強度逐漸增強，當OH-的濃度達到100 mmol·L-1時，配合物的發光強度增強至原來的5倍。同時，隨著OH-濃度的增大，配合物的發射峰位置從550 nm藍移到506 nm。在0～100 mmol·L-1的OH-濃度范圍內，OH-濃度和配合物的發光強度成正比，計算得到Ir2對OH-的LOD為0.396 mmol·L-1，表明配合物Ir2對OH-的檢測具有較高的靈敏度。根據加入的OH-的物質的量和溶液的體積計算得到了溶液的pH，不同pH下的發光照片如圖S10所示。當溶液為中性時，配合物為橙黃光，隨著pH的逐漸增大，溶液發光由橙黃色逐漸變為綠色。配合物Ir2對OH-檢測的選擇性和競爭性實驗結果如圖S11所示，在加入其他陰離子后，配合物Ir2的發射光譜強度均無明顯增強。而在配合物Ir2和其他陰離子的混合溶液中再加入100 mmol·L-1的OH-后，Ir2的發光強度仍能增強至原來的5倍以上，這表明Ir2對OH-的檢測有較強的抗干擾能力。配合物Ir2對OH-識別的可能機理：通過親核取代反應，OH-取代了配合物Ir2的中性配體dbr-bpy中的溴取代基，從而形成了中性配體含有羥基的新的配合物(圖S12)[39]，中性配體上吸電子的溴取代基被供電子能力較強的羥基取代后，會使LUMO能級升高，從而使發射光譜藍移。

3 結論

以4，4′-二溴-2，2′-聯吡啶為中性配體，合成了2種含醛基的Irバ配合物Ir1和Ir2。在光激發下，配合物Ir1和Ir2在乙腈溶液中的發射峰分別位于584和530 nm，發光顏色分別為橙紅光和黃光。配合物Ir1和Ir2在無氧乙腈溶液中的量子效率分別為49%和66%。2種配合物對Cys的加入表現出快速的猝滅型磷光響應，與Cys的結合比為1∶2，而且對Cys的檢測具有良好的選擇性，最低檢測限達到18.5 μmol·L-1。同時配合物Ir2對OH-有良好的識別性能，可以作為增強型的磷光探針應用在OH-的檢測中。本文的研究為設計基于銥配合物的多功能磷光探針提供了思路。

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