一種席夫堿Al3+熒光探針的制備及細胞成像應用

陳 曦李思媛王 元吳偉娜＊,陳 忠＊,

(1河南理工大學化學化工學院，焦作454000)

(2江西科技師范大學材料與機電學院，南昌330013)

0 引言

鋁是地球上儲量第三大的金屬(約占地球重量的8%)。因其具有低密度、抗腐蝕和導熱快等優點，鋁制品被人們大量制造及使用，從而導致環境、生物體內Al3+過量殘留[1]。研究表明，當人體攝入過高含量的Al3+時，會引發許多器官功能障礙，導致相關疾病，如癡呆癥、貧血、阿爾茨海默病、骨關節炎等[2-3]；在水體中過量蓄積的Al3+同樣會導致水生生物的死亡。因此,對環境、生物體內Al3+的快速檢測尤為重要[4-6]。

目前，Al3+的測定方法主要有原子吸收光譜法、離子色譜法、電感耦合等離子體法等[7]。其中，熒光探針檢測法因具有操作簡單快捷、可視性強、識別作用專一性強、靈敏度高、響應時間短、可進行活體分析和在線監測等優點而備受關注[8]。因此，針對Al3+的熒光探針取得了一定進展[9-10]，現有探針通常利用萘[11-13]、氟硼二吡咯(BODIPY)[14]、香豆素[15-16]或羅丹明[17-18]作為熒光團，輔以連接基和識別位點構建。然而，這些熒光基團由于較大的分子量與復雜的合成步驟，在檢測生物性能與成本上受到一定的限制。相比之下，席夫堿類化合物簡便易得[19]，是目前Al3+探針研究的熱點。席夫堿結構中的碳氮雙鍵(C=N)可以與Al3+配位，從而阻止了C=N的異構化，使得體系熒光增強而實現檢測[20-21]。此外，因Al3+具有較高的離子水化能，可在緩沖體系中檢測Al3+且應用于細胞成像的席夫堿熒光探針數量有限。

基于此，我們通過一步縮合反應，高效制備了一例席夫堿類熒光探針1(圖1)。在DMSO/H2O(2∶8，V/V)體系中，探針1可特異性與Al3+配位，導致體系熒光顯著增強，同時伴隨明顯的顏色改變。探針1對Al3+檢測靈敏度高，檢出限低至1.44 μmol·L-1。通過核磁滴定、質譜分析和理論計算研究了探針與Al3+的配位模式和熒光傳感機理，并將其應用于活細胞內Al3+的檢測。

圖1 探針1的合成路徑Fig.1 Synthetic route of probe 1

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所有用于實驗合成的試劑都可以通過商業公司進行購買并直接使用，無需進一步的處理與純化。光譜性質測試中，所有溶劑如二甲亞砜(DMSO)等為光譜純試劑，購自Macklin公司，水為MILIPORE處理過的超純水。元素分析在Vario EL元素分析儀上進行。NMR譜在Bruker AV400 NMR核磁共振儀上測得。熒光光譜在Varian CARY Eclipse分光光度計上測定。電噴霧電離質譜(ESI-MS)在Bruker Daltonics Esquire 6000質譜儀上獲得。在Zeiss Leica倒置落射熒光/反射激光共聚焦掃描顯微鏡上獲得熒光圖像。pH值用PHS-3精密pH計記錄。熒光光譜數據用Origin軟件包處理。

1.2 探針1的合成

將0.193 g(1 mmol)4-(二乙氨基)水楊醛和0.103 g(1 mmol)奧肼以100 mL無水乙醇溶解。在250 mL圓底燒瓶內加熱回流，90℃下反應4 h，點板監測反應過程。反應完成后，冷卻至室溫，有黃色固體析出，抽濾得到產物并用無水乙醇洗滌，得到黃色固體。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ12.13(s，1H，NH)，11.31(d，J=15.15 Hz，1H，OH)，8.51(d，J=5.05 Hz，1H，CH=N)，8.26(s，1H，NH2)，7.39(s，1H，NH2)，7.15～7.99(dd，J=6.07 Hz，2H，NH2)，6.26(m，3H，Aryl-H)，3.33～3.38(d，J=9.02 Hz，4H，2CH2)，1.08～1.11(t，J=6.76 Hz，6H，2CH3)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ162.26,160.37,156.29,152.85,150.92,132.37,106.68，104.25，97.85，44.28，12.99。C13H18N4O3元素分析計算值(%)：C 56.10，H 6.52，N 20.13；實驗值(%)：C 56.18；H 6.28；N 20.24。ESI-MS：m/z=279.151 4[M+H]+。

1.3 探針1的光譜性能測試

將探針1溶于DMSO制得1 mmol·L-1的探針儲備液。探針1的Al3+熒光滴定實驗檢測體系為DMSO-H2O(2∶8，V/V，pH=7.4)。移取20 μL的探針儲備 液，加 入 適 量Al(NO3)3水 溶 液(1 mmol·L-1)，用DMSO定容至5 mL，充分混勻后進行熒光測試。

1.4 金屬離子選擇性實驗

金屬離子選擇性及Al3+與堿金屬、堿土金屬的競爭性實驗都在上述DMSO-H2O體系中進行。將AgNO3、Al(NO3)3、Ca(NO3)2、Cd(NO3)2、Co(NO3)2、CrCl3、Cu(NO3)2、Fe(NO3)3、HgCl2、KNO3、Mg(NO3)2、MnCl2、NaNO3、Ni(NO3)2、Pb(NO3)2、Zn(NO3)2分別溶解，配制成濃度為1 mmol·L-1的金屬儲備液。激發波長為390 nm，狹縫寬度為5 nm。

在探針1對常見金屬離子選擇性實驗中，向2 mL的DMSO-H2O體系中加入20 μL濃度為1 mmol·L-1的探針1溶液到比色皿中，依次分別加入60 μL Al3+(1 mmol·L-1)和60 μL其 它 常 見 金 屬 離 子(1 mmol·L-1)，測定495 nm處的熒光強度。在Al3+識別實驗中，在2 mL的DMSO-H2O體系中，取20 μL濃度為1 mmol·L-1探針1到比色皿中，用微量進樣器不斷加入Al3+溶液，測定495 nm處的熒光強度。在競爭實驗中，向2 mL DMSO-H2O體系中加入20 μL濃度 為1 mmol·L-1的 探 針1溶 液 和60 μL濃 度 為1 mmol·L-1的Al(NO3)3水溶液，然后再分別加入80 μL濃度為1 mmol·L-1的陽離子溶液：Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Na+、Ni2+、Pb2+、Zn2+，充分混合后，記錄光譜。

1.5 細胞毒性和成像實驗

選用Hela細胞為研究對象，在培養有Hela細胞的培養皿中分別加入濃度為0、10、20、30和40 μmol·L-1的探針1，37℃下培養24 h后，通過MTT法測定細胞活力。

將探針1(20 μmol·L-1)孵育的Hela細胞加入到含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中培養30 min，用空白培養基清洗3次，除去過量探針，進行熒光共聚焦成像。加入20 μmol·L-1的Al3+，在37℃培養30 min后，再次進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 探針1對常見金屬離子識別

首先，我們測定了探針1與常見金屬離子的熒光響應。在DMSO-H2O(2∶8，V/V，pH=7.4)的溶液中，探針1(20 μmol·L-1)在390 nm激發波長下無熒光。當加入Al3+后，在495 nm處峰值明顯升高，體系熒光強度增加。且在365 nm的紫外燈下，肉眼可觀察到溶液由無色變為藍綠色(圖2a插圖)。除Zn2+能夠引起探針溶液熒光輕微增強(約為加Al3+時強度的1/8)，其它離子如Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Na+、Ni2+和Pb2+，對探針熒光發射無影響。故該探針可實現對Al3+的選擇性識別。可以作為開啟型Al3+熒光探針。

其次，測定了探針1與Al3+的反應時間，如圖2b所示。實驗結果顯示，將探針1溶解到DMSO-H2O體系，加入60 μmol·L-1的Al3+溶液后，其495 nm處的熒光強度隨時間的增加明顯增強，20 min后熒光強度達到峰值。因此，探針1對Al3+的響應時間為20 min。

圖2 (a)探針1在無金屬離子和加入60 μmol·L-1不同金屬離子后495 nm處的熒光強度;(b)探針1加入60 μmol·L-1 Al3+后495 nm處熒光強度隨時間變化的曲線Fig.2(a)Fluorescence intensity of probe 1 before and after addition of 60 μmol·L-1 different metal ions;(b)Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 495 nm upon treatment with 60 μmol·L-1 Al3+

2.2 探針1對溶液中的Al3+的識別

我們測試了不同的Al3+加入量(每次加入2 μL)對探針1的熒光光譜的影響，結果如圖3所示。熒光光譜圖表明，隨著Al3+加入量的增大，探針1在495 nm處的熒光強度上升。當加入40 μmol·L-1的Al3+時，495 nm處的熒光強度升為最高；將Al3+濃度繼續增加至60 μmol·L-1，熒光強度也基本保持不變。測試了探針1與Al3+反應后的熒光強度與Al3+濃度的關系。如圖3插圖所示，經過線性擬合可得線性回歸方程：y=25.908 66+19.748 88x，R2=0.991 94，說明探針可以定量檢測Al3+。經計算得出檢出限LOD=3σ/k=1.44 μmol·L-1(σ指空白標準偏差，k是線性方程的斜率)，這遠遠低于世界衛生組織規定的Al3+最高允許水平(7.41 mmol·L-1)[22]。

圖3 加入不同濃度的Al3+后探針1的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Al3+with different concentrations

2.3 探針分子的抗干擾能力

探針分子在實際應用中容易受到多種因素的熒光強度干擾。如圖4所示，向探針1-Al3+體系內分別加入60 μL濃度為1 mmol·L-1的Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Na+、Ni2+、Pb2+、Zn2+，其均對體系熒光發射無明顯影響。這一結果說明探針1對Al3+的檢測具有較強的抗干擾能力。

圖4 競爭離子存在下探針1識別Al3+的熒光響應Fig.4 Fluorescence response of probe 1 to Al3+with competition ions

2.4 探針1對Al3+的識別機理

通過ESI-MS實驗分析了探針1與Al3+的反應模式。取1 mg探針溶解在2 mL CH3OH溶液，加入Al(NO3)32 mg，混合20 min后進行ESI-MS測試。如圖5a所示，1+Al3+在m/z321.120 6處出現了新峰，與[Al(1-H)(OH)]+(計算值321.117 9，1+Al3+)相對應。而m/z=335.137 0、349.110 1和417.098 9處的峰歸屬于溶劑化離子[Al(1-H)(OCH3)]+(計算值335.137 9)、[Al(1-H-NH2+OCH3)(OCH3)]+(計算值350.137 9)和[Al(1-H-NH2)(OCH3)(NO3)](計算值416.142 1)。

為了獲得更多關于配合物的信息，我們進行了1H NMR測試。取5 mg探針溶于0.6 mL的DMSOd6中，再加入含5 mg Al(NO3)3的DMSO-d6溶液，等待20 min后進行1H NMR測試，譜圖見圖5b。隨著Al3+的加入，1的OH質子峰消失，說明探針1的羥基脫氫與Al3+配位。同時，探針1的CH=N、NH2和Ar-H質子峰向低場區輕微位移，證實探針1分子中的亞氨基氮原子以及羰基氧原子參與了配位。根據以上實驗結果，推斷1通過ONO給體與Al3+結合，結合模式如圖6所示。

圖5 探針1和1+Al3+的(a)ESI-MS譜圖和(b)1H NMR譜圖(DMSO-d6)Fig.5(a)ESI-MS and(b)1H NMR spectra(DMSO-d6)of 1 and 1+Al3+

圖6 探針1與Al3+離子反應的可能機理Fig.6 Proposed reaction mechanism of 1 with Al3+ion

為了進一步研究探針1與Al3+的配位行為，我們用Gaussian 09程序包和B3LYP交換函數進行密度泛函理論(DFT)計算。如圖7所示，探針1的HOMO集中在席夫堿部分，而LUMO主要位于吡嗪基上，這與其微弱的熒光相一致。探針1的C=N異構化在配合物中被抑制，這是導致熒光增強的原因。配合物形成后，電子云擴展到了包括HOMOs和LUMOs在內的整個探針中，這也支持了這一事實。1+Al3+的HOMO和LUMO之間的能量差為3.14 eV，低于探針1中HOMO和LUMO的能量差(3.56 eV)。結果表明，1與Al3+形成的配合物比1更穩定。

圖7 探針1和1+Al3+的優化結構和分子軌道排布Fig.7 Optimized structures and HOMO/LUMO of 1 and 1+Al3+

2.5 探針1檢測細胞中Al3+

為了評價探針1檢測生物細胞中Al3+的性能，首先進行了探針1的細胞毒性實驗。具體實驗內容為將濃度為0～40 μmol·L-1的探針1分別孵育到Hela細胞中24 h，檢測Hela細胞的存活率，如圖8所示。實驗結果表明，孵育24 h，探針1濃度為40 μmol·L-1時80%的細胞存活，說明探針1細胞毒性較低。

圖8 MTT法測定的探針1對Hela細胞的毒性Fig.8 Toxicity of probe 1 to Hela cells using the MTT assay

之后，我們測試了探針1對細胞中Al3+的成像。37℃下，將10 μmol·L-1探針1與Hela細胞孵育30 min，綠色通道弱熒光(圖9a)；在相同的條件下補加10 μmol·L-1的Al3+，繼續孵育30 min后Hela細胞內綠色通道熒光顯著增強，如圖9d所示。因此，探針1能夠高效檢測細胞中Al3+的存在。

圖9 Hela細胞共聚焦熒光圖像：(a、b、c)37℃下,10 μmol·L-1探針1孵化Hela細胞30 min;(d、e、f)繼續加入10 μmol·L-1 Al3+,37℃孵化該細胞30 minFig.9 Confocal fluorescence images of Hela cells：(a,b,c)Hela cells incubated with 10 μmol·L-1 of probe 1 for 30 min at 37℃;(d,e,f)the cells with probe 1 incubated with 10 μmol·L-1 Al3+for another 30 min at 37℃

3 結論

以4-(二乙氨基)水楊醛和奧肼縮合，合成了一種非常簡單的席夫堿類熒光探針1，該探針對Al3+具有良好的識別作用，受其他金屬離子干擾影響較弱。在DMSO/H2O(2/8，V/V，pH=7.40)溶液中形成配合物，可引起體系熒光增強，且使溶液顏色由無色變為藍綠色，可以用于Al3+的裸眼識別檢測。結合NMR研究表明，配位位點為1中的酚羥基氧原子、亞氨基氮原子以及羰基氧原子。所制備的席夫堿探針1合成簡單、對Al3+選擇性好、檢測靈敏度高，并且能在細胞內實現Al3+的熒光成像，因此在傳感器研制方面具有潛在的應用價值。