牦牛角藥用功效及物質基礎研究進展與資源化利用展望△

趙晶晶，劉睿，武文星，朱昭穎，宿樹蘭，晉玲，昂青才旦，段金廒*

1.南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/國家中醫藥管理局中藥資源循環利用研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；

2.甘肅中醫藥大學 教育部中藏藥省部共建協同創新中心，甘肅 蘭州 730000；

3.青海藏醫院，青海 西寧 810007

牦牛角是牛科動物牦牛Bos grunrtiensL.（藏族語稱yak）的犄角，是傳統藏族醫藥學中的一種特有藥材[1]。牦牛角呈圓錐形，角先向上，再向外，近末端復向內向上，角尖略向后彎；表面呈棕黑色或灰黑色，全角中上部富有光澤，中下部則有縱裂紋及堅硬刺手的疏毛，靠近基部有粗糙狀環紋，習稱“角輪”；基部略扁，鋸口面類圓形，內有堅硬質重的角柱，習稱“骨塞”，骨塞長度約占全角的2/3，表面有突起的縱棱，與其外部角鞘通過軟組織緊密嵌合，內部光滑致密有珍珠光澤；質堅硬，氣微腥，味酸、咸[2]。

本文綜述了牦牛角的化學成分組成、生物活性評價、藥用價值體現、資源化利用等方面的研究進展，并就加強牦牛角的醫藥領域的基礎性研究、研究與制定牦牛角藥材標準、重視牦牛角藥用價值的深度挖掘等方面提出了若干建議，以期為牦牛角這一寶貴民族動物藥資源的多元化、高值化利用提供參考。

1 牦牛角功效物質基礎

1.1 蛋白質及含巰基多肽類

牦牛角入藥部分為外層角鞘，主要成分為角蛋白等蛋白質及多肽類物質。基于同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ），從角類動物藥（犀角、廣角、羚羊角、水牛角、牦牛角、藏羚羊角、山羊角）中鑒定出591個蛋白質，主要為Ⅰ型角蛋白（KRT）、Ⅱ型KRT 等與連接蛋白（junction plakoglobin、plakophilin、desmoglein 等）[3-4]。基于蛋白質類成分定量分析，結合多元統計方法對蛋白質類型、蛋白質相對含量歸類比較，結果表明牦牛角與犀角的蛋白質類成分組成接近。采用二維電泳（2-DE）聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法（MALDITOF-MS）對牦牛角中的蛋白質成分進行分析，鑒定出5個與活性相關的蛋白質成分[5]。

KRT是一種由長而中空的纖維小管組成的復合構造，通過硫交聯（-S-S-）來完成纖維與基體中間的連接[6]。然而，這些含-S-S-鍵的蛋白質在特定條件下降解及-S-S-鍵斷裂，可形成含有巰基（-SH）的多肽、寡肽類物質。采用熒光衍生法測定巰基含量，間接表征角類動物藥中含巰基的多肽、寡肽類含量，結果顯示白牦牛角、黑牦牛角、花牦牛角水提液中的巰基濃度分別為56.5、66.0、69.0 mol·L-1，三者差異較小[7]。

1.2 氨基酸類

采用薄層色譜法及氨基酸分析儀分別對牦牛角中的水解氨基酸進行分析，結果表明牦牛角中含有19 種水解氨基酸，分別為谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、色氨酸。牦牛角所含的人體必需7 種氨基酸中，亮氨酸質量分數最高（4.27%～8.58%），其次分別為蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸。牦牛角中嬰幼兒必需的精氨酸質量分數較高，為6.81%～11.28%[8]。以鄰苯二甲醛柱前衍生法測定白、花、黑3 色牦牛角中牛磺酸質量分數，分別為24.3、32.8、36.4 μg·g-1。對羚羊角、藏羚羊角、犀角、廣角、牦牛角、水牛角中水解氨基酸及必需氨基酸進行聚類分析及相似性評價，結果表明牦牛角在氨基酸組成方面與犀（廣）角最接近[9]。索有瑞等[10]對青海不同地區牦牛角中17 種氨基酸的含量進行分析，結果表明玉樹州牦牛角中氨基酸總量最高，其次為海北州、海南州、黃南州。

1.3 核苷類

采用親水作用色譜-超高效液相色譜-三重四聯串聯質譜法（HILIC-UPLC-QQQ-MS/MS）對羚羊角、藏羚羊角、犀角、廣角、牦牛角、水牛角等角類動物藥中14 種核苷和堿基進行定性和定量分析，結果表明牦牛角中含胸腺嘧啶、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、2′-脫氧肌苷、腺苷、胸苷、尿苷、胞苷13 種核苷及堿基成分，總質量分數為218.02～248.80 μg·g-1。以層次聚類分析和主成分分析對核苷類成分測定結果進行歸類分析，結果表明牦牛角的核苷與堿基含量組成上與犀角相近[11]。

1.4 宏微量元素類

采用原子吸收分光光度法及原子熒光光度法分析白、花、黑3 色牦牛角中的鉛、鎘、銀、汞、硒、錫、砷、硫、硅、磷、鋇、鋰、鎳、鍶、鈣、鉀、鎂、鈉、鋁、鉻、銅、鐵、錳、鋅24 種元素，采用統計方法對其進行聚類分析，結果表明花、白、黑3 種牦牛角，水牛角與犀（廣）角間的相似度趨近。花、白、黑3種牦牛角之間無明顯差異[9]。

對青海不同地區（海北州、海南州、玉樹州、黃南州）牦牛角中的16種宏微量元素進行分析（表1），結果表明這些元素在牦牛角中長期蓄積的分布量隨地區不同存在較大的差異[12]。有研究者分別采用不同數學模型計算分析青海高原不同地區牦牛角中微量元素綜合得分，對產地質量進行綜合評價，結果顯示海南州共和縣所產牦牛角質量最優，依次是玉樹州、海北州、海南州貴南縣、黃南州[13-16]。

表1 青海省不同地區牦牛角宏微量元素分析

1.5 其他類物質

本課題組前期建立了動物角中膽固醇的高效液相色譜蒸發光散射法（HPLC-ELSD），測得白、花、黑3 色牦牛角中游離膽固醇質量分數分別為3.77、3.73、3.61 mg·g-1，總固醇質量分數分別為3.890、3.964、3.627 mg·g-1；運用分光光度法對白、花、黑3 色牦牛角中的氨基己糖進行分析，質量分數分別為1.932、1.899、1.923μg·g-1；甾類HPLC 圖譜相似度評價發現，3 種牦牛角、水牛角、藏羚羊角與犀（廣）角的甾類成分相近，無明顯差異[9]。對青海不同地區牦牛角的常規化學成分測定結果表明，牦牛角干物質中以粗蛋白為主，平均質量分數為82.7%，其次為粗脂肪、粗纖維。干物質、粗蛋白、粗脂肪、灰分等主要化學成分質量分數在海北州牦牛角中最高，其次為玉樹州、黃南州、海南州[10]。

2 生物活性

2.1 解熱活性

牦牛角超細粉對過期三聯疫苗-NS 致發熱家兔具有解熱作用，口服給予1.5 g·kg-1（以生藥量計）牦牛角后90 min 產生明顯的解熱作用，且作用維持到給藥后120 min[9,17]。經熱提法所得的牦牛角中牦牛肽粗提取液對酵母致發熱小鼠具有解熱效應[18-19]，并且呈劑量依賴性。比較分別以3、9 g·kg-1生藥劑量的西藏牦牛角與水牛角替代古方犀角湯中的犀角后對發熱家兔的解熱作用，結果表明以牦牛角替代的犀角湯給藥后60 min 表現出明顯的解熱作用，藥效維持4 h以上，解熱效應優于以水牛角替代的犀角湯[20]。采用微量熱技術表征羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液作用于模式生物（大腸埃希氏菌）時的生物反應差異，以建立相應的生物反應指紋來評價動物角樣本的生物熱特性，結果表明羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液給藥后均減少了大腸桿菌生長的總熱量，提示羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角具有潛在的抗菌特性，與傳統角類藥物具有解熱作用觀念相一致[21]。基于活性導向對牦牛肽粗提物及牦牛角熱提液進行分離，跟蹤分離產物的解熱鎮痛活性，結果表明牦牛角熱水提取液中肽類成分活性確切，這些肽類成分對熱穩定，相對分子質量＜30 kDa[18-19]。

2.2 鎮靜、鎮痛活性

采用光電法與協同戊巴比妥鈉睡眠實驗探究牦牛角鎮靜效應，結果表明灌胃給予牦牛角（1.375、2.750、5.500 g·kg-1，以生藥量計）能明顯減少小鼠自發性活動次數及延長小鼠睡眠時間，且鎮靜作用呈一定劑量依賴性[9,22]。采用熱板法和醋酸扭體法探究牦牛角鎮痛效應，結果表明牦牛角經熱提及5%的堿提所得肽粗提物具有明顯的鎮痛活性[18-19]。采用醋酸扭體法探究經熱提所得的牦牛角肽粗提物的鎮痛效應，結果表明牦牛角肽粗提物組小鼠扭體次數遠低于空白組小鼠，提示牦牛角肽粗提物具有較強的鎮痛活性[19]。

2.3 凝血與活血雙重活性

研究表明，經不同提取方式得到的牦牛角提取物的凝血作用呈現雙重藥理學活性，采用毛細管法探究牦牛角超細粉對小鼠凝血時間的影響，口服給予5.5 g·kg-1生藥牦牛角超細粉后，小鼠凝血時間較空白對照組顯著縮短（P＜0.05），表明牦牛角原粉具有一定的促進凝血作用[9]。牦牛角超聲提取液可顯著延長家兔血漿復鈣時間、凝血酶時間和凝血酶原時間，具有良好的抗凝作用[23]。觀察牦牛角超聲提取液對家兔體外血栓溶解率和全血凝塊在12、24、48 h 溶解率以評價牦牛角的抗血栓作用，結果表明牦牛角超聲提取液對家兔體外血栓溶解率與空白組差異有統計學意義（P＜0.01），全血凝塊48 h溶解率可達94%，具有良好的抗血栓作用[23]。牦牛角的主要生物活性見表2。

表2 牦牛角生物活性

3 現代用藥劑型

角類藥物在使用方面尚存在有效成分溶出率低、患者順應性差等劣勢。為此，有團隊研究了一種牦牛角新型藏藥飲片炮制方法[24]，即取牦牛角粉進行水解、超聲提取，得到濾液和濾渣，將濾渣進行2次提取，合并3 次濾液并調節pH，得到牦牛角提取液，加入輔料牛奶和黃酒后濃縮、干燥，得到牦牛角藏藥飲片。所制得的牦牛角藏藥飲片口服異味小、口感好，有效成分含量提高，炮制時間短，適合于工業生產。此外，制備牦牛角膠凝膠劑亦可改善溶出率與順應性問題[25]，即將牦牛角進行破碎、漂洗、浸泡、砂燙，將砂燙后的牦牛角在pH 4.5～5.5 的條件下加入蛋白酶混合液酶解，然后煎煮，所獲煎煮液加入明礬攪拌、靜置，除沫后加入冰糖、黃酒、豆油和凝膠劑進行加熱濃縮，至清膠液開始掛旗呈稠膏狀，冷卻至半固體后切制、攤晾，獲得牦牛角膠，其L-羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸4 種氨基酸質量分數平均提高97.20%。

4 建議與展望

動物藥資源是我國中醫藥體系的重要組成部分，在我國有悠久的應用歷史，由于其臨床療效顯著，為歷代醫藥學家推崇，為民族健康與發展做出了獨特貢獻。近年來動物藥研究與開發備受關注，其相關科學研究逐漸深入和系統[26]。

4.1 牦牛角的傳統功效物質基礎與生物學機制科學表征有待深入

相較于植物源藥材，我國動物源藥材的功效物質等基礎性研究尚有較大差距，除了自身理化性質較為復雜外，其蛋白質類及雜化的糖蛋白、糖肽、糖脂等生物大分子物質的分離純化、結構鑒定、活性表征和作用機制闡明均存在技術瓶頸，有待生命科學的進一步發展和生物化學與分子生物學的進步提供關鍵支撐。迄今，關于牦牛角的藥用價值研究以其解熱、鎮靜、凝血、抗血栓等活性的初步研究較多，尚缺乏系統深入的傳統功效物質基礎和作用機制研究。因此，需要進一步對牦牛角的蛋白質類、多（寡）肽類、特殊氨基酸類、特征小分子類等多種類型化學組（成）分進行系統分析與活性評價，并結合生物化學、分子生物學、細胞生物學及多組學技術揭示牦牛角傳統功效的科學內涵，為牦牛角新資源藥材的開發提供系統的科學證據。

類效物質替代是解決動物藥資源供給不足的有效策略，人工牛黃、人工麝香已是成功的典范。揭示其功效物質基礎與作用機制，是類效物質替代策略的關鍵環節，也是替代產品創制的基礎和前提。圍繞珍稀角類動物性藥材的功效物質及其替代性研究取得了一定的進展。基于“物質基礎-生物效應-體內過程”開展牦牛角、山羊角、水牛角替代羚羊角應用基礎研究[27]，基于活性肽組釋放與類效性評價牦牛角、山羊角替代資源[28]，基于蛋白質組的水牛角、山羊角替代羚羊角類效性研究[29]，基于“蛋白質/肽組-修飾組”研究策略建立動物藥質控新模式[30]等，對珍稀動物藥替代資源的發現進行了不懈的探索。

4.2 牦牛角的多元化高附加值產品開發利用亟待加強和深入

中藥資源學研究內容貫穿于中藥資源生產與利用全過程，通過進一步集成現代科學體系中藥學、生物學、化學與分析學、工程技術、信息技術等理論與方法，服務于中藥資源的合理生產與科學利用，為我國牦牛資源經濟產業鏈的延伸、資源利用效率和經濟效益的提升、資源性產品的品質提高等提供有力支撐，為充分挖掘和釋放青藏高原牦牛資源產業蘊含的巨大價值潛能提供有效的支持。通過科技賦能，逐步改變長期以來依賴自然資源和依靠粗放、廉價、低效的資源耗竭式發展方式和層次結構相對較低的發展模式，不斷拓展和推動這一特色藥用動物資源多層次、多途徑開發模式的形成，必將造福于民族區域經濟，豐富我國動物藥資源寶庫。

中藥資源是國家戰略資源，是中醫藥事業和中藥產業發展的物質基礎。探索中藥資源的科學保護和合理開發利用，以及新資源發現和替代性研究等諸方面的理論和技術創新，保障中藥資源的可持續利用是中藥及民族藥物資源永恒的話題。隨著以中藥及天然藥物資源為原料的資源產業鏈日益延伸，中藥資源經濟在國民經濟和生物醫藥行業的地位日益凸顯，國內外消費市場對綠色產品的需求不斷提高。應采取積極的尋找替代和資源補償策略，聚焦藥用價值大、資源供給難的中藥材品種，采用行之有效的多元化手段，切實解決保障供給問題。