二氫楊梅素對小鼠的抗疲勞作用及機制研究△

尹美玲，孫樂，滕李利，宋顏君，許利嘉，肖培根

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所/中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室

在快速發展的社會，疲勞已成為常見的社會問題，影響人們的工作效率和生活質量[1]。疲勞是指身體極其疲憊的狀態，包括精神疲勞和體力疲勞[2]。研究發現體力疲勞的產生與代謝物積累、能量紊亂、機體氧化應激損傷等相關[3]。

近些年研究發現，植物來源的天然產物，如黃酮類化合物，對改善疲勞有重要作用[4-5]。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種天然黃酮，藥理活性廣泛[6-8]。前期文獻報道DMY具有緩解疲勞的作用，但具體的機制還有待深入研究[9-11]。結合本課題組前期研究基礎，本研究采用跑輪實驗和負重游泳力竭實驗研究DMY 的抗疲勞作用，通過分析DMY 對小鼠生化指標、能量代謝和氧化應激通路相關基因和蛋白表達的影響，挖掘其抗疲勞的潛在作用機制，為后續深入研究提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級ICR 雄性小鼠32 只，4 周齡，體質量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010，由中國醫學科學院藥用植物研究所倫理委員會審批，審批號為SLXD-20210115017，飼養于12 h 明暗交替、溫度（22±2）℃、相對濕度為（55±10）%環境中，小鼠自由獲取食物和水，用于后續跑輪實驗。

SPF 級ICR 雄性小鼠32 只，體質量為18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所動物實驗中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2016-0006，由中國醫學科學院藥用植物研究所倫理委員會審批，審批號為SLXD-20201030014，小鼠飼養于12 h明暗交替的動物房內，飼養溫度為（23±2）℃，相對濕度為45%～65%，允許小鼠自由攝食和飲水，用于后續負重游泳力竭實驗。

1.2 試藥

DMY（本課題組制備提取，純度為98%）；乳酸（LD）測定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、尿素氮（BUN）測定試劑盒、肌酸激酶（CK）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）測定試劑盒測定試劑盒（江蘇南京建成生物工程研究所）；TranZol Up Plus RNA kit、TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）、PerfectStart ?Green qPCR SuperMix（北京全式金生物科技有限公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、超敏熒光化學發光試劑盒（碧云天生物技術研究所）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔抗體、HRP標記山羊抗小鼠抗體、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體、磷酸化AMPK（pAMPK）抗體、核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）抗體（美國CST 公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）抗體（英國Abacm 公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，北京索萊寶生物科技有限公司）；肝激酶1（LKB1）、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）、腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、組蛋白去乙酰化酶（SIRT1）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（PGC-1α）、Nrf2、谷胱甘肽過氧化酶1（GPx-1）、血紅素家氧酶-1（HO-1）、解偶聯蛋白2（UCP2）、PPARα、GAPDH引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）引物序列

1.3 儀器

YLS-10B 型小鼠轉輪式疲勞儀（上海軟隆科技發展有限公司）；游泳水箱（自制）；1-14k型高速低溫離心機（德國Sigma 公司）；Infinite M1000 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；XMTD-8222型智能數顯控溫儀（上海精宏實驗設備有限公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；G560E Vortex-Genie 2 型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；OSE-MC8 型臺式離心機[天根生化科技（北京）有限公司]；H2O3-H 型加熱制冷型金屬浴[卡尤迪生物科技（北京）有限公司]；SIM-F140 型制冰機（日本Sanyo 公司）；NanoPhotometer 型分光光度計（美國Implen 公司）；Fastprep-24 ?5G 型快速樣品制備儀（美國MP Biomedicals 公司）；BE-6100 型微孔板迷你離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Veriti?型96孔熱循環儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CFX96 型實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀、PowerPac Basic 型電泳儀和ChemiDoc ? Touch Imaging System型蛋白顯影儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 跑輪實驗

2.1.1動物分組與給藥 小鼠隨機分為4 組，分別為對照組和DMY 低、中、高劑量組，每組8 只。對照組小鼠每日按體質量灌胃給予0.5% CMC-Na（0.01 mL·kg-1）；DMY 溶于0.5% CMC-Na 水溶液中制成混懸液，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃20、40、80 mg·kg-1。各組小鼠每日上午給藥1 次，連續給藥7 d，給藥期間可以自由攝水和飲食。實驗結束后小鼠注射速眠新麻醉，脫頸椎處死。

2.1.2小鼠跑輪實驗 末次給藥結束后，將小鼠放進帶跑輪系統的機器中，先以16、20 r·min-1適應性訓練各15 min，共30 min，再使用24 r·min-1直到小鼠力竭。記錄小鼠在24 r·min-1速度下的跑步力竭距離。

2.2 負重游泳力竭實驗

2.2.1動物分組與給藥 小鼠的分組和給藥劑量設置同2.1.1項下。

2.2.2小鼠負重游泳實驗 末次給藥后30 min，在小鼠尾根處系上相當于5%體質量的鉛絲，依次放入水深約30 cm、水溫為（24±2）℃的游泳箱中游泳。以小鼠頭部沉入水中7 s內未浮出水面作為判斷小鼠力竭的標準，記錄此時間為小鼠的游泳力竭時間。

2.2.3小鼠血清及組織樣本收集 負重游泳實驗結束后，繼續灌胃給藥2 d，末次給藥后30 min，于2.2.2項下相同游泳裝置中，各組小鼠無負重游泳15 min 后注射速眠新麻醉，摘眼球取血，靜置一段時間，3500 r·min-1離心10 min（離心半徑為0.6 cm），得到血清上清液，轉移至-80 ℃冰箱保存。脫頸椎處死小鼠后取得腿部骨骼肌、肝臟組織，用0.9%氯化鈉溶液浸洗掉血漬，濾紙吸干組織表面水分后，將組織包在錫箔紙中迅速置于液氮，隨后轉移至-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.3 血液生化指標測定

采用LD、LDH、CK、BUN 檢測試劑盒，按說明書要求將血清稀釋成合適質量濃度，分別檢測其中LDH、CK活性及LD、BUN含量。

2.4 肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px測定

稱取適量肌肉和肝臟組織，加入0.9%氯化鈉溶液勻漿，分別采用LD、肌/肝糖原、GSH-Px 檢測試劑盒檢測肌肉中LD 和肝臟中糖原的含量，以及肝GSH-Px的活性，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5 mRNA表達量檢測

分別稱取小鼠骨骼肌組織和肝臟組織15～25 mg，加入TranZol 裂解液0.8 mL。按TranZol Up Plus RNA kit 試劑盒說明提取總RNA。得到的RNA 樣品取少量用于總RNA的純度和濃度檢測。按TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒的使用說明進行反轉錄反應。按PerfectStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒說明書進行qRT-PCR。以GAPDH為內參基因，mRNA相對表達量按2-ΔΔCt計算。

2.6 相關蛋白測定

稱取適量小鼠骨骼肌和肝臟置于裂解液中，冰上裂解30 min 提取總蛋白，12 000 r·min-14 ℃離心20 min（離心半徑為0.6 cm），得到組織上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定骨骼肌的蛋白質量濃度，然后加入1/4體積的loading buffer，95 ℃煮沸蛋白，得到實驗樣品。采用SDS-PAGE 分離樣品，然后將樣品轉移到活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗4 ℃冰箱過夜；次日先用TBST 清洗3 次，每次10 min，然后分別加入對應的二抗室溫孵育1 h，再用TBST 洗3 次，每次10 min，隨后用電化學發光顯影曝片，并保留相關條帶，使用Image J 1.4.3 軟件分析計算各蛋白灰度值。

2.7 統計學方法

所有實驗數據以（ˉx±s）表示，數據符合正態分布且方差齊時采用單因素方差分析，兩組之間的差異用獨立的t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析，使用GraphPad Prism 6軟件制圖。

3 結果

3.1 DMY對小鼠體質量及跑步力竭距離的影響

如表2 所示，在實驗開始前和實驗結束后，對照組及DMY各給藥組小鼠組間的體質量差異無統計學意義。與初始體質量比較，實驗結束時各組小鼠體質量有明顯增長（P＜0.001）。在實驗過程中，各組小鼠精神狀態正常、皮毛光滑，沒有打斗痕跡或其他異常狀況。DMY 各劑量對小鼠的體質量及生長發育沒有不良影響。與對照組比較，DMY 各劑量均能顯著延長小鼠的跑步力竭距離（P＜0.001）。

表2 各組小鼠體質量及跑步力竭距離（, n=8）

表2 各組小鼠體質量及跑步力竭距離（, n=8）

注：與同組初始體質量比較，###P＜0.001；與對照組比較，***P＜0.001。

3.2 DMY對小鼠體質量及負重游泳時間的影響

如表3 所示，負重游泳實驗進行過程中，對照組及DMY各給藥組小鼠在實驗開始前和實驗結束后組間的體質量差異無統計學意義。與初始體質量比較，實驗結束時各組小鼠體質量明顯增長（P＜0.01，P＜0.001）。在實驗過程中，各組小鼠無異常狀況發生。與對照組比較，DMY 各劑量均能不同程度地延長小鼠的負重游泳力竭時間（P＜0.05，P＜0.001）。

表3 各組小鼠體質量及負重游泳時間（, n=8）

表3 各組小鼠體質量及負重游泳時間（, n=8）

注：與同組初始體質量比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

3.3 DMY 對小鼠血清LD、LDH、SUN 和CK 水平的影響

結果如表4 所示，運動后，與對照組比較，DMY 各劑量可以顯著降低小鼠血清中LD 水平和LDH 活性（P＜0.05）。DMY 中、高劑量組小鼠的SUN水平顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。DMY中劑量組小鼠血清中CK活性顯著低于對照組小鼠（P＜0.05）。

表4 各組小鼠血清LD、SUN水平和LDH、CK活性（, n=8）

表4 各組小鼠血清LD、SUN水平和LDH、CK活性（, n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表5～8同。

3.4 DMY對小鼠肌肉LD、肝糖原和肝GSH-Px水平的影響

結果表明，與對照組比較，DMY 各劑量組小鼠肌肉中LD 水平均降低，其中DMY 低、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）；肝糖原水平升高，其中DMY 中劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）；DMY 高劑量組小鼠肝GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px水平（, n=8）

表5 各組小鼠肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px水平（, n=8）

3.5 DMY 對小鼠骨骼肌AMPK 信號通路基因表達的影響

如表6 所示，與對照組比較，DMY 各劑量組小鼠骨骼肌中AMPK通路LKB1、CaMKK2、AMPKα2、SIRT1、PGC-1αmRNA表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表6 各組小鼠骨骼肌AMPK通路蛋白mRNA相對表達量（, n=5）

表6 各組小鼠骨骼肌AMPK通路蛋白mRNA相對表達量（, n=5）

3.6 DMY 對小鼠肝臟Nrf2 通路、PPARα 通路相關基因表達的影響

如表7 所示，與對照組比較，DMY 各劑量組小鼠肝臟中Nrf2、HO-1、GPx-1、PPARα、UCP2 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表7 各組小鼠肝臟氧化應激相關蛋白mRNA相對表達量（, n=5）

表7 各組小鼠肝臟氧化應激相關蛋白mRNA相對表達量（, n=5）

3.7 DMY 對小鼠肌肉AMPK 及肝臟Nrf2、PPARα蛋白的影響

Western blot結果顯示（表8和圖1），DMY 可以顯著增加小鼠肌肉中pAMPK/AMPK的比值，激活了AMPK信號通路（P＜0.01）。此外，DMY也可以顯著增加小鼠肝臟Nrf2、PPARα蛋白的表達（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肌肉AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白表達

表8 各組小鼠肌肉pAMPK/AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白相對表達量（, n=3）

表8 各組小鼠肌肉pAMPK/AMPK和肝臟Nrf2、PPARα蛋白相對表達量（, n=3）

4 討論

DMY 是一種黃酮類化合物，前期文獻報道其具有緩解疲勞的作用，但具體的機制還有待深入研究[9-11]。運動時機體會產生疲勞，近年來研究發現疲勞的產生與體內代謝物堆積、能量損耗、氧化應激等因素有關[12-13]。疲勞最直接的體現就是運動耐力的下降[14]，跑輪實驗、負重游泳實驗等常作為小鼠耐力和疲勞狀態等指標的評價方法[15]。因此，本實驗采用跑輪實驗模型和負重力竭游泳模型驗證DMY的抗疲勞作用，并對其緩解疲勞的機制深入研究。研究結果表明，DMY 顯著延長了小鼠跑步力竭距離和負重游泳力竭時間，對提高小鼠運動耐力及緩解體力疲勞有顯著作用。

葡萄糖是肌肉活動時能量的主要來源，主要以糖原的形式儲存在肝臟和肌肉中[16]。糖原的含量與機體的運動耐力有密切關系。機體運動時，肌糖原直接消耗提供能量，隨著肌糖原逐漸減少，為了維持血糖穩定，肝糖原會分解成葡萄糖，如果肝糖原耗竭，血糖明顯下降，運動不能繼續，因此肝糖原的儲量直接反映機體運動耐力的水平。肝糖原儲備越多，運動持續時間越長，運動耐力越強，抗疲勞作用越強[17]。運動后，DMY 各組小鼠的肝糖原水平顯著高于對照組，證明了DMY緩解疲勞的有效性。

當劇烈運動時，機體呈現相對無氧狀態，肌肉糖酵解供能占主導，肌肉和血液中積累大量LD，同時LDH 控制著肌肉LD 的代謝反應，LD 增多，H+濃度增加，引起機體神經傳導、糖酵解及肌肉收縮等功能障礙，影響能量的產生、釋放和儲存，進一步導致疲勞發生[18-19]。當運動時間延長，糖和脂肪酸的氧化無法滿足能量供應時，蛋白質和氨基酸代謝增加維持能量供應，導致血清BUN 含量增加，反映機體對負荷的適應能力較差。此外，血清BUN 的含量越少，也說明機體內蛋白質代謝參與供能較少，糖和脂肪類能源物質供應充足，這可以與肝糖原的實驗結果相印證。另外，血清中CK 的含量是反映機體過度勞累及間接反映肌肉損傷的重要指標。CK的活性升高，提示肌肉受損及機體疲勞[20-21]。與文獻報道的結果相似，本研究結果證明，DMY 可以顯著降低疲勞小鼠肌肉LD，血清LD、SUN 的含量，降低血清LDH 和CK 的活性，具有緩解疲勞的作用，改善了疲勞小鼠的能量代謝水平。

AMPK 途徑在機體的能量合成和代謝中有重要作用。在運動過程中，肌肉中的AMPK 受上游AMPK 激酶，包括肝激酶1（LKB1）和鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶1（CaMKK1）和CaMKK2 的調節[22]。AMPK 下游的SIRT1 是一種煙堿腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的蛋白去乙酰化酶，參與調節生物代謝過程，可以激活PGC-1α基因表達[20]，從而調節葡萄糖代謝、葡萄糖攝取及線粒體的生物合成[23]。本研究結果表明，DMY 顯著增加LBK1、CaMKK2 mRNA 表達，激活AMPKα2 及下游SIRT1和PGC-1αmRNA 的表達，并且顯著增加了AMPK磷酸化水平，表明DMY 可能激活了AMPK 能量代謝途徑，為肌肉運動提供更多能量。

當劇烈運動時，機體進入氧化應激狀態，產生大量活性氧（ROS）自由基，影響機體生物大分子的氧化，從而加速疲勞的產生[24]。此時，機體的抗氧化能力對于緩解機體疲勞有重要作用。肝臟是體內代謝的重要器官，在運動過程中，除儲存糖原外，也參與調節GSH-Px 等抗氧化酶的分泌。GSH-Px 是一種機體廣泛存在的過氧化物分解酶，可以清除ROS 等代謝產物，調節機體的氧化平衡，保護細胞正常功能[25-26]。本研究表明，DMY 高劑量可以增加抗氧化酶GSH-Px 活性，提示DMY 抗氧化的作用機制可能與GSH-Px 的促分泌有關。進一步探討DMY抗氧化的可能作用機制，Nrf2 是細胞抗氧化的重要因子，其活化后進入細胞核，與抗氧化反應元件結合，激活下游HO-1、GPx-1等抗氧化基因表達及抗氧化酶GSH-Px 的分泌[3]。實驗結果表明，DMY 可以顯著上調肝臟Nrf2、HO-1和GPx-1基因的表達及顯著增加肝Nrf2 蛋白的表達，提示DMY 可能作用Nrf2相關通路發揮抗氧化作用。

此外，PPAR 是一類激素受體，其中PPARα的表達可以增強機體的氧化能力，改善脂質代謝[27]，并且PPARα可以調控下游UCP2 的分泌，在線粒體的氧化應激中發揮重要作用[28]。已有文獻報道DMY可以上調疲勞小鼠肌肉中PGC-1α和PPARα基因表達[10]。在本研究中，實驗結果顯示，DMY 可以顯著上調肝臟PPARα和UCP2基因表達，并且其顯著上調了肝PPARα蛋白表達，提示DMY 可能作用PPARα相關通路提高疲勞小鼠抗氧化的能力。

綜上所述，DMY 可能通過激活肌肉AMPK 通路及肝Nrf2 和PPARα相關通路改善小鼠疲勞。本研究報道了DMY 對上調Nrf2 和PPARα蛋白表達的顯著作用，為DMY 抗疲勞的機制探索提供了參考，相關的機制研究仍需深入，以助力DMY 的深度開發。