烷氧基三聯吡啶釕配合物的合成、結構及其與DNA相互作用

郭 輝汪 濤蘇文卿李 丹陳興星吳杰穎張 瓊＊,,3田玉鵬＊,,3

(1安徽大學化學系，功能無機材料化學安徽省重點實驗室，合肥230601)

(2安徽大學生命科學學院，合肥230601)

(3南京大學配位化學國家重點實驗室，南京210023)

許多釕、銥、鉑等貴金屬配合物具有良好的生物特性[1-3]，其中最受關注的是Ruギ配合物，該類配合物具有d6電子構型，有多種電子組態和電荷躍遷方式，形成的配合物光物理信息豐富，熱力學穩定性高，且具有低毒性、易吸收等優點，被廣泛應用于生物領域[4-8]。Ruギ配合物中，多吡啶類釕配合物易于構筑結構繁多的八面體構型，這類配合物可以識別DNA的二級結構，可作為DNA結構探針[9-11]，近年來在抗癌藥物的研發中嶄露頭角。

中山大學計亮年院士和巢暉課題組在該領域取得了顯著成績[12-14]，他們設計、合成了一系列不對稱釕配合物，可與DNA以2種方式結合[15]。配合物與DNA存在多種結合方式，DNA的雙螺旋結構是由磷酸殘基和脫氧核糖組成，其中磷酸帶負電，可以和帶正電的離子以靜電引力結合，當配合物具有一個平面性較好的配體時，配合物就可以插入DNA分子的堿基對或雙螺旋溝槽之中發生插入作用，同時還存在疏水作用、氫鍵等結合方式。我們希望通過對配體的修飾得到具有良好光物理性質和生物相容性的釕配合物[16-17]。因此，設計、合成了一種含柔性鏈的烷氧基三聯吡啶配體，并與釕ギ配位。所制備的配合物不僅具有良好的剛性平面，可以很好地插入DNA分子，還含有氯離子或溶劑分子，更易與DNA靜電結合[18-19]；而且烷氧鏈和BF4-、PF6

-的引入極大增強其生物相容性，能夠得到期望的具有優良生物相容性的釕配合物。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-吡啶甲酸乙酯、二乙二醇單甲醚、2，2′-聯吡啶、四氟硼酸鉀購自上海潤捷化學試劑有限公司。六氟磷酸鉀購自阿拉丁化學試劑公司。溴化乙錠(EB)購自麥克林化學試劑公司。硝酸銀、氫化鈉、活性炭、乙酸銨、溴己烷、18-C-6、碳酸鉀、三乙胺、氯化鋰、三氯化釕購自上海久岳化工有限公司。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)購自江蘇化學試劑有限公司。以上原料和溶劑均為AR級。文中紫外可見、熒光、圓二色譜測試所用配合物溶液均為10 μmol·L-1。理論計算采用含時密度泛函理論(TD-DFT)對配合物的紫外可見躍遷進行計算。DNA等生物大分子均溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，配成質量濃度5 mg·mL-1的溶液。每次測試前DNA等生物大分子與配合物溶液孵育5 min。

FT-IR譜圖由NEXUS-870型紅外光譜儀測得，經KBr壓片。1H NMR和13C NMR譜圖在Bruker公司的Bruker400 Ultra-shield核磁共振儀上獲得。配合物的晶體結構是在SMART CCD(Seimens)X衍射儀上用MoKα射線測定的。質譜表征：MALDI-TOFMS在AXIMA-CFR plus型飛行時間質譜儀上測得，ESI-MS使用LCQ Fleet型質譜測定。紫外可見吸收光譜使用日立U-3900紫外可見分光光度計測定。分子對接用AutoDock4.2軟件進行。

1.2 配合物的合成

配合物的合成步驟如圖1所示。

圖1 配合物的合成路線Fig.1 Synthesis route of the complexes

1.2.1 配體L的合成

tpy-OH根據文獻方法合成[20]。在150 mL的圓底燒瓶中依次加入tpy-OH(3.00 g，12.00 mmol)、溴己烷(3.95 g，48.00 mmol)、K2CO3(1.01 g，49.20 mmol)、0.5 g 18-C-6，加入100 mL丙酮溶解，80℃回流攪拌24 h。溶液由無色變成淺黃色，冷卻到室溫，抽濾得濾液。用旋轉蒸發儀蒸出大量丙酮，加入500 mL蒸餾水，析出白色固體。抽濾并水洗3次，真空干燥，得到白色固體L3.60 g，產率92%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ8.64(dd，J=4.7，0.6 Hz，2H)，8.59(d，J=8.0 Hz，2H)，7.96(s，2H)，7.89(tt，J=9.1，4.5 Hz，2H)，7.38(ddd，J=7.4，4.8，1.1 Hz，2H)，4.19(t，J=6.5 Hz，2H)，1.81(dq，J=13.1，6.6 Hz，2H)，1.52～1.45(m，2H)，1.39～1.30(m，4H)，0.89(t，J=7.0 Hz，3H)。13C NMR(CDCl3，150 MHz)：δ14.05,22.61，25.64，29.01，31.51，68.24，76.73，77.05，107.41，121.35，123.77，136.78，149.01，156.21，157.01，167.38。ESI-MS(m/z)：[M]+計算 值333.25，實 驗 值333.18；MALDI-TOF-MS：333.18。

1.2.2Ru-L的合成

稱取2.00 g(6.00 mmol)L溶于50 mL乙醇中，將三氯化釕(1.34 g，6.50 mmol)先溶于50 mL乙醇再滴加到配體中，回流反應4 h。有棕黃色固體析出，抽濾出固體，依次用蒸餾水和乙醇各洗滌3次(3×20 mL)。在150 mL圓底燒瓶中，將棕黃色固體(0.54 g，1.00 mmol)加入到20 mL的混合溶劑乙醇/水(3∶1，V/V)中，攪拌均勻。再將2，2′-聯吡啶(0.19 g，1.20 mmol)、LiCl(0.38 g，10.00 mmol)和3 mL三乙胺加入其中，回流攪拌4 h，冷卻至室溫，減壓蒸出溶劑，用二氯甲烷/甲醇(20∶1，V/V)柱層析，得紫黑色固體。

1.2.3Ru-Cl的合成

取紫黑色化合物Ru-L，用甲醇溶解，在避光條件下加入AgBF4(0.23 g，1.20 mmol)的乙腈溶液，攪拌2 h，離心，取上清溶液，濃縮，得紫黑色產物，產量：0.51 g，產率：70.2%。m.p.332℃。ESI-MS(m/z)：[MBF4

-]+計算值626.13，實驗值626.33。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ10.08(d，J=5.2 Hz，1H)，8.89(d，J=8.2 Hz，1H)，8.75(d，J=8.1 Hz，2H)，8.63(d，J=8.2 Hz，1H)，8.54(s，2H)，8.31(t，J=7.9 Hz，1H)，8.02(t，J=6.5 Hz，1H)，7.97(t，J=7.8 Hz，2H)，7.76(t，J=7.9 Hz，1H)，7.60(d，J=5.5 Hz，2H)，7.44(d，J=5.9 Hz，1H)，7.34(t，J=6.5 Hz，2H)，7.09(t，J=6.3 Hz，1H)，5.76(s，2H)，4.46(t，J=6.4 Hz,2H)，1.98～1.88(m,2H)，1.63～1.53(m，2H)，1.49～1.33(m，4H)，0.94(t，J=6.8 Hz，3H)。IR(KBr，cm-1)：3 428(m)，2 971(vw)，2 814(w)，2 721(w)，1 631(s)，1 596(s)，1 469(w)，1 424(w)，1 381(m)，1 353(m)，1 214(w)，848(m)，762(m)，564(m)。

1.2.4Ru-NCMe的合成

在N2氛圍下的史萊克瓶(包裹錫箔紙)中加入Ru-L(0.66 g，1.00 mmol)和AgPF6(0.14 g，2.21 mmol)，加入30 mL乙腈，升高溫度至80℃，反應7 h。冷卻至室溫，抽濾，將所得濾液蒸出部分乙腈，用水擴散得到紅色固體。產量：0.58 g，產率：75.1%。m.p.271℃。ESI-MS(m/z)：[M-2PF6-]2+計算值316.09，實驗值316.17。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.64(d，J=5.2 Hz，1H)，8.94(d，J=8.2 Hz，1H)，8.84(d，J=8.0 Hz，2H)，8.70(d，J=8.1 Hz，1H)，8.63(s，2H)，8.41(s，1H)，8.11(t，J=7.8 Hz，2H)，8.04(s，1H)，7.93(s，1H)，7.71(d，J=5.3 Hz，2H)，7.49～7.41(m，3H)，7.22(s，1H)，4.48(t，J=6.2 Hz，2H)，2.33(s，3H)，1.99～1.89(m，2H)，1.58(s，2H)，1.40(d，J=12.1 Hz，4H)，0.95(t，J=6.6 Hz，3H)。IR(KBr，cm-1)：3 416(m)，3 064(w)，2 942(w)，2 935(w)，2 860(w)，1 800(w)，1 626(s)，1 590(s)，1 468(w)，1 382(m)，1 208(m)，790(m)，762(m)，657(m)。

1.3 晶體數據收集與解析

取25 mg配合物Ru-Cl、Ru-NCMe分別溶解在10 mL乙醇中，用過濾針管過濾在透明光滑小瓶中，自然揮發數天，分別得到紫色、紅色透明的針狀晶體。選取大小適中的晶體作單晶X射線衍射分析，在SMART CCD(Siemens)X衍射儀上，用石墨單色器、MoKα射線(λ=0.071 069 nm)、ω/2θ掃描方式采集數據。利用SHELXTL-97程序，全矩陣最小二乘法定義F2直接法解析晶體結構，氫原子的坐標經差值Fourier合成獲得，非氫原子坐標通過直接法獲得。氫原子采用各向同性熱參數修正，其它原子采用各向異性熱參數修正。CCDC：1063055，Ru-Cl；1577329，Ru-NCME。

2 結果與討論

2.1 Ruギ配合物的晶體結構

單晶解析后所得晶體學數據見表S1(Supporting information)，主要鍵長、鍵角見表S2和S3。Ru-Cl、Ru-NCMe的晶體均為單斜晶系C2/c空間群。圖2為Ru-Cl、Ru-NCMe的單分子橢球圖。2個配合物的主體結構均為含配位單元的陽離子，陰離子分別為BF4-和PF6-離子。從晶體結構可以看出，三聯吡啶與聯吡啶所在平面相互垂直，中心Ru原子分別與三聯吡啶和聯吡啶的N原子以及Cl-離子(乙腈分子)發生配位，采取六配位模式，形成近似正八面體的構型。2個分子的N—Ru鍵的鍵長大致相等，在0.196 8～0.208 3 nm之間，說明在Ru原子附近的電子云分布較均勻。Ru-Cl分子的N4—Ru1—Cl1的角度為172.78°，Ru-NCMe分子的N6—Ru1—N5的角度為173.91°，這是由于Cl-離子的孤對電子與聯吡啶N原子上電子排斥導致配位發生扭曲。在分子堆積方面(圖S7)，2個配合物的分子間都存在靜電引力作用。Ru-NCMe晶體在PF6-的連接下沿著b軸方向形成一維鏈狀結構，而Ru-Cl晶體由于有分子間氫鍵的存在，形成層狀結構。如圖3所示，Ru-Cl晶體中與Ru原子配位的氯原子和另外2個分子的吡啶環上的氫原子相連形成氫鍵。

圖2 配合物Ru-Cl(a)、Ru-NCMe(b)的50%橢球概率晶體結構圖Fig.2 Crystal structure with 50%ellipsoidal probability of complexes Ru-Cl(a)and Ru-NCMe(b)

圖3 配合物Ru-Cl的分子間氫鍵Fig.3 Intermolecular hydrogen bonds of complex Ru-Cl

2.2 Ruギ配合物的光學性質

2.2.1 紫外可見吸收光譜

測得2種配合物在不同極性溶劑中的紫外可見吸收光譜，結果如圖4所示。從圖4a和4b可以看出，這2種釕配合物在不同極性的溶劑中，吸收峰位置受溶劑極性影響較小，只發生了微小的移動。表明這2種配合物的基態偶極矩并不大，分子基態能級僅有微小的改變，且在與生物體環境相似的溶液中(φDMSO=10%的水溶液)仍具有良好性質(圖4c)。在400～600 nm范圍內Ru-Cl的最大吸收波長相比于Ru-NCMe有所紅移，這是由Ru-Cl中氯離子配體的強吸電子性質引起的。同時因為含有Ru—Cl鍵，配體與金屬離子結合更加穩定，配體與金屬離子之間的電荷躍遷能級更低，電荷更容易躍遷，所以Ru-Cl配合物吸收波長相對較長，吸收峰更寬。

圖4 (a)Ru-Cl和(b)Ru-NCMe在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜;(c)Ru-Cl和Ru-NCMe在含DMSO(φDMSO=10%)的水溶液中的紫外可見吸收光譜;(d)Ru-Cl(510 nm)和Ru-NCMe(460 nm)的前線分子軌道能級圖Fig.4 UV-Vis absorption spectra of(a)Ru-Cl and(b)Ru-NCMe in different solvents;(c)UV-Vis absorption spectra of Ru-Cl and Ru-NCMe in an aqueous solution containing DMSO(φDMSO=10%);(d)Frontier molecular orbitals energy diagram of Ru-Cl(510 nm)and Ru-NCMe(460 nm)

2.2.2 理論計算

由2種配合物的紫外可見吸收光譜圖和理論計算可知，2個分子在290～300 nm均有吸收峰，可歸屬為配體內的π→π*特征吸收峰；在315 nm附近的吸收峰，可歸屬為配體到金屬離子的電荷轉移(LMCT)過程；而在520和460 nm的寬吸收峰是金屬到配體的電荷轉移(MLCT)的吸收峰。配合物Ru-Cl在380 nm附近的特征吸收峰可歸屬于分子內電荷轉移(ICT)過程。前線分子軌道能級圖如圖4d所示，Ru-Cl分子的MLCT過程的電荷躍遷所需能量更低，這與上述推測結果一致。

2.3 Ruギ配合物與DNA作用

2.3.1 Ruギ配合物特異性識別DNA

在系統研究Ruギ配合物和DNA的相互作用之前，我們首先排除了配合物和一些常見的生物大分子發生相互作用的可能性。在相同濃度的生物大分子加入到配合物溶液之后，配合物的吸收強度有不同程度的下降。根據下降的程度制成如圖5所示的柱狀圖，可以看到一些常見的氨基酸、卵磷脂和RNA等對配合物的吸收強度影響很小，只有在加入DNA時配合物吸收強度有明顯變化。表明配合物對DNA有特異性識別作用，有望將其應用于復雜的生物體環境。

圖5 與DNA、RNA、氨基酸作用后Ru-Cl和Ru-NCMe的吸收光譜變化圖Fig.5 Changes in absorption spectra of Ru-Cl and Ru-NCMe after interacting with DNA,RNA,and amino acids

2.3.2 Ruギ配合物與DNA作用的吸收光譜

為了進一步探索配合物和DNA的結合，分別向2種Ruギ配合物溶液中加入DNA母液，測試其吸收光譜，結果見圖6。從圖6中可以看出，隨著DNA的不斷加入，2種Ruギ配合物溶液的吸收強度均有所減弱，表明2種配合物均與DNA發生作用。由配合物結構推測，這種作用可能是配合物的己氧基三聯吡啶配體與DNA發生了插入作用，隨著插入作用的不斷增強，減色效果越來越明顯。

圖6 與DNA相互作用后Ru-Cl、Ru-NCMe紫外可見吸收光譜的變化Fig.6 Changes in UV-Vis absorption spectra of Ru-Cl and Ru-NCMe after the interaction with DNA

2.3.3 Ruギ配合物與DNA作用的熒光光譜

DNA分子結構復雜，只通過一種方法很難確定配合物與其結合模式。為了確定Ruギ配合物與DNA的結合模式，采用DNA-EB體系來進一步研究配合物與DNA的作用機理。EB是一種可以嵌入DNA堿基之間的染色劑，與DNA結合后發出強烈的熒光。在其他可以和DNA發生插入反應的試劑加入后，先前與DNA結合的EB的熒光會發生變化，因此可以用配合物與EB的競爭實驗間接來確定配合物與DNA的插入作用。

從圖7可知，隨著配合物加入量的增加，DNAEB體系的熒光強度逐漸降低，這可以說明Ruギ配合物與DNA發生了插入作用，導致體系熒光減弱。同時我們可以看出，在與EB競爭過程中，Ru-Cl與DNA作用比Ru-NCMe強，對體系的熒光強度減弱作用較明顯。從紫外可見吸收光譜可知，2種分子均可以和DNA作用，而在熒光光譜中Ru-NCMe分子在與EB競爭實驗中效果不明顯，推測其有其它結合方式。從結構來看Ru-NCMe的第3配體為乙腈分子，其和中心金屬結合能力較弱，易于離去，使配合物能以靜電或配位方式與帶負電的DNA結合。在Ru-Cl配合物中由于Ru—Cl鍵較穩定，即使能發生少部分水解，但是對與DNA的插入反應影響不大，熒光強度仍為明顯降低的趨勢。

圖7 加入Ru-Cl和Ru-NCMe后DNA-EB體系熒光光譜的變化Fig.7 Changes in fluorescence spectra of DNA-EB system after the addition of Ru-Cl and Ru-NCMe

2.3.4 Ruギ配合物與DNA作用的圓二色譜

圓二色譜(CD)法是一種可以直觀地判斷配合物有沒有和DNA分子發生插入反應的方法[21-22]。如果配合物可以與DNA發生插入反應，配合物溶液的加入會使DNA的CD峰的強度發生變化。DNA加入2種配合物后的CD譜圖如圖8所示，隨著Ru-Cl的加入，DNA在275 nm的峰強度逐漸降低，證明Ru-Cl可以和DNA發生插入反應，反觀Ru-NCMe的加入對DNA的CD影響很小，峰的強度幾乎沒有變化，表明Ru-NCMe和DNA發生的反應不是以插入反應為主。

圖8 加入Ru-Cl和Ru-NCMe后DNA的CD譜圖的變化Fig.8 Changes in CD spectra of DNA after the addition of Ru-Cl and Ru-NCMe

2.3.5 Ruギ配合物與DNA作用的分子對接

通過理論模擬分子對接進一步研究配合物和DNA分子的具體結合方式。選取在DNA-EB體系中變化明顯的Ru-Cl配合物，分子對接如圖9所示。從圖9a可以看出，配合物的烷氧基三聯吡啶配體與DNA的結合位點位于DNA雙螺旋的溝槽中。從圖9b得知配合物和DNA之間存在疏水作用力，疏水作用類型分別為π-π、alkyl、π-alkyl，且DNA側鏈上的NH2可以與配合物的氧原子形成氫鍵。

圖9 DNA-配體表面結合位點(a)和Ru-Cl與堿基相互作用的棒狀圖(b)Fig.9 DNA-ligand surface binding site(a)and stick pattern of the interactions between Ru-Cl and base(b)

2.3.6 Ruギ配合物與DNA作用的核磁滴定

由分子對接我們知道配合物的烷氧基三聯吡啶配體可以插入DNA分子雙螺旋的溝槽中，且存在疏水作用和氫鍵。為了驗證理論模擬的準確性，進行了Ruギ配合物與DNA的核磁滴定測試[23-24]，測試結果如圖10所示。隨著DNA的加入，2種配合物苯環區氫的化學位移均往高場移動(紅色)。這是由于配合物與DNA發生π-π堆積等疏水作用，使得苯環區化學位移發生變化。同時由于烷氧基三聯吡啶中的氧原子與DNA分子的氨基以氫鍵相連，使得氧原子附近的氫的化學位移同樣向高場移動(藍色)。

圖10 隨著DNA的加入Ru-Cl和Ru-NCMe核磁氫譜的變化Fig.10 Changes in 1H NMR spectra of Ru-Cl and Ru-NCMe after the addition of DNA

因為設計、合成的2種配合物均沒有熒光，所以對這2種配合物與DNA的其它結合方式的驗證受到限制，沒有進行靜電結合的實驗驗證。

3 結論

設計并合成了2種長鏈烷氧基三聯吡啶釕配合物Ru-Cl、Ru-NCMe，通過單晶X射線衍射確定了它們的結構。經過DNA-EB競爭實驗和圓二色譜研究發現，Ru-Cl可以和DNA發生插入反應，且插入效果明顯。而經過理論模擬發現Ru-Cl除與DNA發生插入反應之外，還存在氫鍵和疏水作用。由于2種配合物有相同的三聯吡啶配體，推測Ru-NCMe同樣存在氫鍵和疏水作用，并通過核磁滴定得到了驗證。本工作設計的2種配合物Ru-Cl、Ru-NCMe均可以特異性識別DNA，且存在多種結合方式，其中Ru-Cl以插入反應為主，表現出良好的穩定性，Ru-NCMe存在氫鍵和疏水作用，還有可能存在靜電作用，而且乙腈分子配位提供了其它功能配體取代的活性位點。后期可以通過配體修飾使其熒光增強，得到能夠特異性識別DNA的熒光探針，在癌癥診療等方面擁有巨大潛力。

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