經典名方半夏厚樸湯物質基準量值傳遞分析△

李玲玲，陳盛君，李松，祝倩倩，王協和，李媚，文紅梅

1.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023；

2.江陰天江藥業有限公司技術中心，江蘇 江陰 214434；

3.江蘇省中藥配方顆粒制備與質量控制關鍵技術重點實驗室，江蘇 江陰 214434；

4.江蘇省中藥配方顆粒工程技術中心，江蘇 江陰 214434

半夏厚樸湯出自漢代張仲景的《金匱要略》，全方由半夏、厚樸、茯苓、紫蘇和生姜組成，具有行氣散結、降逆化痰的功效，是治療因情志不遂、肝氣郁滯、痰氣互結、停聚于咽所致“梅核氣”的經典名方[1]。“梅核氣”多發于成年女性，常見于現代醫學的咽神經官能癥、咽異感癥、慢性咽炎等[2]。現代臨床研究表明，半夏厚樸湯還具有治療胃食管反流病、慢性胃炎、功能性消化不良、哮喘、咳嗽、慢性咽炎及抑郁等作用，尤其在抗抑郁及改善胃腸功能等方面效果顯著[3-9]。

關于半夏厚樸湯的研究多集中于復方加減聯合化學藥的現代臨床應用，目前尚未有其物質基準量值傳遞的相關文獻報道。本研究以半夏厚樸湯為研究對象，選取道地產區和主產區多批樣品，按照古法進行煎煮，制備物質基準，建立復方超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜，以野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚為定量指標，建立半夏厚樸湯物質基準質量標準，為后續制劑的工藝研究和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2L-YMW 型機械分體煎藥壺（潮州市港鈿工藝制作廠）；JE502 型電子天平、JSB3-01 型電子秤（上海浦春計量儀器有限公司）；ACQUITY-UPLCH-Class 型色譜儀（Waters 公司）；Vanquish F 型超高效液相色譜儀（Thermo 公司）；ME204 型百萬分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16C型高速臺式離心機（無錫樓蘭儀器系統有限公司）；PO Lab plus-L 型純水系統（Satorius公司）。

1.2 試藥

對照品野黃芩苷（批號：110842-201709，純度：91.7%）、迷迭香酸（批號：111871-201505，純度：98.5%）、厚樸酚（批號：110729-201714，純度：100.0%）、和厚樸酚（批號：110730-201614，純度：99.3%）、咖啡酸（批號：110885-200102，純度：99.7%）、6-姜辣素（批號：111833-202007，純度：99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS000711，純度＞95%）；甲醇、乙腈、磷酸、甲酸均為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

本研究所用的半夏、厚樸、茯苓、紫蘇葉、生姜均購于各自道地產區或主產區，經江陰天江藥業有限公司工程師唐波鑒定，半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥樹皮、根皮及枝皮，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，紫蘇葉為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉，生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖。利用Excel 表格隨機組合方式形成15 批半夏厚樸湯飲片組合，編號為S1～S15（表1）。

表1 15批半夏厚樸湯飲片信息

2 方法與結果

2.1 物質基準的制備

通過飲片炮制、處方劑量考證確定處方藥味及用量，根據《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》及古籍記載內容[10]，對煎煮瓦數、濾過目數、是否加蓋、濃縮溫度4個因素進行考察，確定半夏厚樸湯物質基準制備的工藝參數。

注：15批生姜的產地均為云南。

按處方比例分別稱取姜半夏15 g、姜厚樸9 g、茯苓12 g、紫蘇葉6 g、生姜15 g 置于煎藥壺中，加水1400 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持沸騰至約800 mL，過200 目篩，65 ℃條件下減壓濃縮至約580 mL，冷凍干燥得半夏厚樸湯凍干粉（1 g凍干粉相當于7.03～12.62 g生藥量）。同法制備多批凍干粉及缺姜半夏陰性樣品、缺姜厚樸陰性樣品、缺茯苓陰性樣品、缺紫蘇葉陰性樣品、缺生姜陰性樣品及各單味藥樣品。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1色譜條件 采用ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～13 min，2%～17%A；13～19 min，17%A；19～38 min，17%～34%A；38～42 min，34%A；42～55 min，34%～40%A；55～68 min，40%～90%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為280 nm。

2.2.2供試品溶液制備 取本品凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。同法分別制備缺姜半夏、缺姜厚樸、缺茯苓、缺紫蘇葉、缺生姜陰性樣品溶液。

2.2.3精密度試驗 取半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，按照2.2.1 項下色譜條件重復進樣6次，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復性試驗 平行制備6 份半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，按照2.2.1 項下色譜條件測定，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明該方法的重復性較好。

全面訓練。高三復習不能只注重重點知識，從今年的高考命題可以看出，有些知識來源于教材的細微之處，如若復習過程不全面，可能會造成重大失誤。

2.2.5穩定性試驗 取半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h進樣測定，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.2.615批半夏厚樸湯特征圖譜 特征圖譜可較全面反映中藥復方所含化學成分的種類及數量，實現整體質量控制。按照2.2.2項下方法制備半夏厚樸湯物質基準S1～S15供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄UPLC圖，將S1～S15樣品色譜圖以.cdf格式導入“中藥色譜特征圖譜相似度評價系統”（2012版），采用中位數法，時間窗寬度為0.1 min，進行全譜峰匹配，共發現12個共有峰（圖1），相對保留時間的RSD均小于2.0%。以對照圖譜計算半夏厚樸湯物質基準相似度（表2），S10 相似度＜0.90，其余相似度均大于0.90，測定發現該批和厚樸酚、厚樸酚峰面積較小，可能與不同批厚樸飲片含量差異有關。

表2 15批半夏厚樸湯物質基準共有峰相似度

圖1 15批半夏厚樸湯物質基準UPLC特征圖譜

2.2.7共有峰歸屬及指認 根據15 批物質基準特征圖譜，共標定了12個共有峰（圖1）。通過與對照品比對，指認出峰2為咖啡酸、峰8為野黃芩苷、峰9為迷迭香酸、峰10為6-姜辣素、峰11為和厚樸酚、峰12 為厚樸酚。經指認，峰1 來自姜半夏，峰2、5～9 來自紫蘇葉，峰3～4、11～12 來自姜厚樸，峰10來自生姜（圖2）。

圖2 半夏厚樸湯物質基準、陰性樣品、單味飲片、對照品UPLC特征圖譜

2.2.8特征圖譜分析

2.2.8.1聚類分析（CA）將15 批樣品特征圖譜的12 個共有峰峰面積處理成量化特征峰數據，采用SIMCA 13.0 軟件進行CA。結果顯示，15 批樣品分為2 類，S3～S6、S8、S14 聚為一類，S1、S2、S7、S9～S13、S15 聚為一類，可能與不同產地飲片之間的配伍有關，其中S3～S6、S8、S14主要由山西運城的姜半夏、四川綿陽的姜厚樸、湖南湘潭的紫蘇葉配伍組成。

2.2.8.2主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 軟件對15批樣品的12個共有峰進行降維因子PCA，提取相關性矩陣數據（表3）。結果顯示，15 批半夏厚樸湯物質基準提取到了3個主成分。

表3 15批半夏厚樸湯樣品PCA矩陣

2.2.8.3正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）將15 批樣品的12 個共有峰峰面積導入SIMCA 13.0軟件進行OPLS-DA，選擇3個主成分，其模型關鍵參數：模型對X矩陣的解釋率（R2X）、模型對Y矩陣的解釋率（R2Y）、模型的預測能力（Q2）值分別為0.803、0.925、0.829，說明該模型具有較好的擬合能力及預測能力。OPLS-DA得分圖（圖3）中，15批樣本聚為2類，與CA結果一致。OPLS-DA載荷圖中，圓點距離原點越遠，表明色譜峰權重值越大，對樣本的影響越大，根據OPLS-DA載荷圖（圖4），F9、F8、F4距離原點較遠，為主要影響成分。模型中變量重要性投影（VIP）值圖（圖5）中，一般認為VIP值＞1的色譜峰對樣本的影響較大，為主要差異成分。綜合圖4～5，篩選出對樣本影響較大的4個色譜峰，按影響程度依次為F9＞F8＞F3＞F4，其中F3、F4經質譜也未解析出其成分。

圖3 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA得分圖

圖4 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA載荷圖

圖5 半夏厚樸湯樣品OPLS-DA VIP值

2.3 含量測定

本研究綜合特征分析篩選出的對樣本影響較大的色譜峰及處方發揮藥效作用的有效成分，以野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚為指標成分，建立半夏厚樸湯物質基準的含量測定方法。

2.3.1色譜條件 野黃芩苷采用Acclaim ?RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2）色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm），以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～17 min，15%A；17～18 min，15%～70%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL；檢測波長為330 nm。迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚按2.2.1項下色譜條件測定。

2.3.2供試品溶液制備 按照2.2.2 項下方法制備半夏厚樸湯物質基準供試品溶液。

2.3.3對照品溶液制備 取野黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成野黃芩苷質量濃度為9 μg·mL-1的溶液，即得野黃芩苷對照品溶液。取對照品迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚適量，精密稱定，加50%甲醇制成迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚質量濃度分別為22、10、10 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.4線性關系考察 取野黃芩苷對照品溶液，按照2.3.1 項下色譜條件進樣，進樣體積分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 μL；取迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚混合對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣，進樣體積分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL，測定峰面積，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線（表4）。

表4 野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚線性關系

2.3.5精密度試驗 取同一半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，分別按2.3.1 及2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，計算供試品溶液中野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.6重復性試驗 平行制備6 份半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，分別按2.3.1及2.2.1項下色譜條件進樣，計算供試品溶液中野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚含量的RSD 均小于2.0%，表明各指標成分方法重復性良好。

2.3.7穩定性試驗 取半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h 按2.2.1 項下色譜條件測定，計算供試品溶液中迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚48 h 峰面積的RSD；按2.3.1 項下色譜條件測定，計算供試品溶液中野黃芩苷24 h 峰面積的RSD，結果均小于2.0%，表明迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚在供試品溶液制備后48 h 內穩定性良好，野黃芩苷在供試品溶液制備后24 h內穩定性良好。

2.3.8加樣回收率試驗 取已知含量的半夏厚樸湯物質基準凍干粉（S1）0.1 g，精密稱定，平行9份，分成3 組，依次精密加入野黃芩苷對照品溶液5、10、15 mL（加入比例分別為0.5∶1.0、1∶1、1.5∶1.0），再加入50%甲醇使加入的溶液體積為25 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析，計算供試品溶液中野黃芩苷的加樣回收率及RSD。加入迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚混合對照品，2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，計算供試品溶液中迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚的加樣回收率及RSD。野黃芩苷、迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚的回收率分別為95.08%、96.49%、98.87%、100.12%，RSD均小于3.0%，表明其含量測定方法準確性良好。

2.3.9專屬性試驗 取半夏厚樸湯物質基準（S1）供試品溶液、缺紫蘇葉陰性樣品溶液按2.3.1項下色譜條件測定，得專屬性圖譜（圖6）。表明野黃芩苷專屬性良好。迷迭香酸、厚樸酚、和厚樸酚專屬性見特征圖譜圖1。

圖6 野黃芩苷專屬性圖譜

2.4 15批半夏厚樸湯物質基準量值傳遞分析

2.4.1含量測定 取15 批半夏厚樸湯物質基準凍干粉，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，分別按2.3.1及2.2.1 項下色譜條件測定。按公式（1）計算野黃芩苷、迷迭香酸、和厚樸酚、厚樸酚轉移率（表5）。15 批半夏厚樸湯物質基準中，厚樸酚與和厚樸酚總質量分數為0.09%～0.40%，均值為0.24%；野黃芩苷質量分數為0.13%～0.33%，均值為0.24%；迷迭香酸質量分數為0.20%～0.74%，均值為0.43%。厚樸酚與和厚樸酚總量的轉移率為7.18%～18.96%，均值為11.69%；野黃芩苷轉移率為46.04%～88.30%，均值為62.77%；迷迭香酸轉移率為29.91%～72.94%，均值為51.06%。

表5 15批半夏厚樸湯物質基準4個指標成分的質量分數、轉移率、出膏率

由于飲片性狀、質地不均，含量差異較大，其溶出率存在一定差別，致使15 批半夏厚樸湯厚樸酚、和厚樸酚總質量分數及轉移率范圍超出規定范圍；湖南省及湖北省厚樸絲細、質地松軟、含量偏低，煎煮時溶出率高，其轉移率較高。野黃芩苷、迷迭香酸的轉移率基本在均值的70%～130%，其含量離散型數據可能與處方及飲片含量差異有關。

2.4.2出膏率 精密稱取半夏厚樸湯物質基準（S1～S15）濃縮液各10 g，置于質量恒定的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至質量恒定，取出，置于干燥器中冷卻30 min，稱定質量，按公式（2）計算出膏率。15 批半夏厚樸湯物質基準出膏率為9.01%～15.83%，均值為12.88%，基本在均值的70%～130%，未出現相差較大離散數據。

3 討論

3.1 物質基準工藝考察

本研究根據半夏厚樸湯物質基準的制備煎煮終點質量考察3 個不同產地復方飲片煎煮30、60、90、100、110、120 min的吸水量，繪制吸水量-時間曲線圖，發現復方飲片吸水量1 h后基本趨于穩定，1 h左右的吸水量為82.1 mL。按公式（3）計算理論終點質量。

半夏厚樸湯物質基準的野黃芩苷、迷迭香酸、%厚樸酚、和厚樸酚4 個含量指標分為兩類，一類為紫蘇葉中的酚酸類及黃酮類成分，一類為姜厚樸中的脂溶性成分，而紫蘇葉屬于芳香類藥物，依據《醫療機構中藥煎藥室管理規范》中規定解表類、清熱類、芳香類藥物不宜久煎。考察現代煎煮法與古代煎煮法4 個指標成分的轉移率，結果顯示，古法煎煮厚樸酚、和厚樸酚轉移率高于現代煎煮，現代煎煮野黃芩苷、迷迭香酸轉移率高于古法煎煮。古法煎煮時間長，有利于厚樸酚、和厚樸酚脂溶性成分的溶出，現代煎煮法煎煮時間短，有利于紫蘇葉中的野黃芩苷、迷迭香酸的保留，這與古法煎煮功率考察結果一致。以經典名方“遵古”為前提，結合半夏厚樸湯的主要藥效成分及厚樸為臣藥、紫蘇葉為佐藥的因素，選用古法煎煮制備物質基準。

3.2 野黃芩苷含量測定條件的優化

野黃芩苷與其相鄰的木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的相對分子質量相同，互為同分異構體，對于兩者的分離較為困難。前期考察了不同色譜柱（HSS T3、ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD、Thermo 苯基柱、Poroshell 120 EC-C18、Thermo Syncronis C18、ZORBAX SB-C18RRHD、CORTECS T3）、不同流動相（甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-乙腈-磷酸水溶液）均很難使野黃芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷很好地分離。后續采用對苯環羥基有選擇性的色譜柱，如Polaris 5 NH2（250 nm）、Acclaim?RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2，100 nm）均可有效分離野黃芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷，考慮到長期使用Polaris 5 NH2，色譜柱中的氨基會脫落影響柱效，不宜使用。故野黃芩苷與木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的分離采用AcclaimTMRSLC PolarAdvantage Ⅱ（PA2）色譜柱。對比不同甲酸酸度（0.05%、0.10%、0.20%）、不同酸（磷酸、冰乙酸、甲酸），發現0.2%甲酸水溶液對野黃芩苷的分離效果較好，確定野黃芩苷含量測定流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液。

半夏厚樸湯用藥精煉、組方嚴謹，具有行氣散結、降逆化痰功效，是治療“梅核氣”的經典方劑。為保證經典名方制劑質量療效一致，需建立從藥材到飲片、中間體、制劑全過程的整體質量控制，嚴格把控制備過程中的質量情況。本研究采用特征圖譜、指標性成分含量測定、轉移率及出膏率相結合的模式，對經典名方半夏厚樸湯基準的量值傳遞過程進行分析，初步建立了科學穩定的質量評價方法，可為后續研究及相關制劑的質量控制提供參考。