基于質量源于設計理念和信息熵賦值法優化枸杞子抗氧化功能性提取物的工藝△

侯憲捷，曾文俊，丁建寶，李艷萍，馬建龍，楊銳，楊晉，4*

1.北方民族大學 化學與化學工程學院，寧夏 銀川 750021；

2.國家民委化工技術基礎重點實驗室，寧夏 銀川 750021；

3.寧夏五行科技有限公司，寧夏 銀川 750002；

4.寧夏天然藥物工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021；

5.寧夏大學 化學化工學院，寧夏 銀川 750021

中藥作為我國獨特的醫療衛生資源，在保障人民健康方面發揮著不可替代的作用。但中藥生產過程中的不確定性、質量控制的復雜性，以及長期以來產品質量依靠終端檢驗，忽略了對原料質量屬性和生產工藝過程的理解，造成中藥制劑的質量不穩定[1-2]。因此，提升和穩定產品質量、加速中藥生產工藝的標準化、促進中藥工業向現代化科技升級，需要更加科學和系統的方法。

質量源于設計（QbD）理念是目前國際公認的先進控制理念，是一種以預期目標為導向、基于系統性風險管理的開發方法[3]。該理念將質量控制重心轉移至原料控制和生產過程控制，通過評估可能影響質量的變量，確定有針對性的策略，使產品質量始終處于可接受的范圍，為藥品質量的風險管理和持續改進提供了方法[4-5]。在QbD 理念指導下，可以通過以下策略對全過程進行風險防控，明確各工藝所影響的質量標準，進而實現產品的質量穩定性和可控性：1）確定關鍵質量屬性（CQAs）；2）辨識關鍵原料屬性（CMA）和關鍵工藝參數（CPPs）；3）建立關鍵工藝單元數學模型；4）構建工藝穩定的設計空間；5）不斷改進控制策略[6-11]。

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目的功效[12]。現代研究認為，枸杞子通過抗氧化來實現長壽[13-14]。大量的研究結果表明，枸杞子的抗氧化活性是枸杞多糖和小分子化合物的協同作用[15-18]，提取方法不同可能會影響提取物的抗氧化活性[17-18]。因此，以抗氧化活性為CQA，在QbD 理念指導下，研究和優化枸杞子抗氧化功能性提取物（AOE）的工藝，建立數學模型并確定設計空間，制定提取工藝的控制策略，為開發以生物活性為導向的枸杞子提取物工藝優化和控制方法提供參考。

中藥“形之于外”的藥性是藥材整體化學物質群綜合生物效應的體現[4]。前期的研究也表明，枸杞子中小分子化合物以不同途徑發揮抗氧化作用[19]。以單一指標作為CQA 來評價制備工藝的優劣具有片面性，大多研究選取多個指標成分，再通過主觀或客觀賦權法得到綜合評價指標，對中藥提取工藝進行優化[20-21]。主觀賦權法主要根據經驗進行判定，受研究者的主觀影響大[22]。客觀賦權法經過對實驗數據的整理、計算和分析，得到權重系數，數據可靠性更高[23]。信息熵作為一種廣泛使用的客觀賦權法，能清晰地反映實驗數據的客觀規律、降低了主觀因素對實驗結果的影響，已經在多種中藥提取工藝優化研究中取得良好的效果[21,23-28]。

本研究采用信息熵理論，計算枸杞子提取物體外鐵離子還原能力（FRAP）、清除2,2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS）和羥自由基（OH·）能力的信息熵和權重系數，確定提取物體外抗氧化能力（M），結合總固形物質量，作為CQAs；在QbD 理念指導下，析因分析初步篩選CPPs，通過Box-Behnken 設計建立CQAs 和CPPs 之間的數學模型，建立并優化AOE制備工藝的設計空間，在保證產品質量的前提下，獲得最優工藝參數，為大工業生產和制備工藝的標準化和規范化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FD-1C-50 型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；手動移液器（德國Eppendorf 公司）；Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

2,4,6-三(2-吡啶基) 三嗪（TPTZ，批號：190516）、ABTS（批號：190826）購于上海泰坦科技有限公司；三氯化鐵（FeCl3）六水化合物（批號：180615）、冰醋酸（批號：170823）、過硫酸鉀（K2SO4批號：190816）、硫酸亞鐵（FeSO4）七水合物（批號：200425）購于天津市大茂化學試劑廠；鹽酸（純度：36%）、水楊酸（純度：99%）、過氧化氫（H2O2，純度：30%）購于國藥集團化學試劑有限公司；維生素C（批號：190315，上海泰坦科技有限公司）。

枸杞子購于寧夏中寧縣，經寧夏農林科學院李彥龍高級工程師鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實，樣品保存于北方民族大學。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

稱取枸杞子20.0 g，以去離子水為提取溶劑，采用水提法，濾過，合并提取液，減壓濃縮，定容至100 mL 量瓶中，從中精密吸取濃縮液，凍干后，即為樣品，待測。

2.2 抗氧化能力測定

供試品溶液的制備：取枸杞子提取物樣品200 mg，以去離子水溶解并定容至10 mL 量瓶中，搖勻，稀釋成質量濃度分別為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg·mL-1的溶液。

2.2.1FRAP測定 FRAP工作液配制：將0.3 mol·L-1醋酸緩沖液、10mmol·L-1TPTZ溶液、20mmol·L-1FeCl3溶液以10∶1∶1混合，即得工作液。

FRAP 測定：分別吸取不同質量濃度供試品溶液0.2 mL 于試管中，并加入工作液3.9 mL。在37 ℃下孵育10 min后，在593 nm處測定吸光度，每組平行3 次，以維生素C 溶液為陽性對照。在FeSO4標準曲線中計算供試品溶液對應的FeSO4濃度[29-30]，方程為Y=1.018 5X+0.062 2（r=0.999 8）。

2.2.2ABTS 自由基清除能力測試 ABTS 基液的配制：將7 mmol·L-1的ABTS溶液和2.45 mmol·L-1的K2SO4溶液以1∶1 混合，于暗處孵育12～16 h，即得。

ABTS工作液的制備：將ABTS基液用去離子水稀 釋（20～40 倍）至波長734 nm 處吸光度為（1.000±0.005），即得。

ABTS 自由基清除能力測試：取不同質量濃度供試品溶液0.2 mL 于試管中，加入工作液3.9 mL，室溫下孵育5 min，測量反應混合物在734 nm 處的吸光度，去離子水做空白對照，以維生素C 溶液為陽性對照，并計算1/半數抑制率（IC50）[31-32]。

2.2.3OH·清除能力測試 按照順序依次加入供試品溶液0.2 mL，9 mmol·L-1FeSO4溶液、9 mmol·L-1水楊酸溶液各1 mL于試管中，然后加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液1 mL 啟動反應。37 ℃孵育30 min，于510 nm 處測定反應溶液的吸光度，去離子水做空白對照，以維生素C溶液為陽性對照，并計算1/IC50值[31,33]。

2.3 信息熵賦值法綜合評價提取物的M

首先建立原始數據矩陣，經過歸一化處理之后得到指標概率矩陣，然后計算出各指標的熵和權重系數，某一項評價指標下的數據之間差異性越大，熵越小，權重系數反而越大，最后將指標概率矩陣中的數據加權處理，即可得到綜合評價指標[23-24]，具體步驟如下。

1）建立原始矩陣(Xij)mn。

xij表示第j次實驗時第i個評價指標的取值。

2）將原始矩陣X轉化為指標概率矩陣(Pij)mn。

3）計算第i個評價指標的信息熵（H）。

4）計算第i個評價指標的權重（W）。

5）依據各指標的W，計算M。

2.4 總固形物質量測定

按照《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）“2201 浸出物測定法”項下方法測定，精密量取枸杞子提取液5 mL，置于已經干燥恒重的蒸發皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中放置30 min，迅速精密稱定質量，計算總固形物質量[34]。

2.5 CQAs和CPPs水平的篩選

以工藝可控性較強的料液比（A）、提取次數（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為考察因素，各因素水平見表1，采用24-1分式析因設計篩選CPPs，實驗設計見表2，每種設計組合重復2次，結果見表3。

表1 枸杞子提取工藝因素水平

表2 AOE的提取工藝24-1分式析因設計及各批次FRAP、ABTS IC50、OH·清除能力IC50、總固形物和M值

2.6 CQAs和CPPs水平的模型建立

為確立提取工藝中CQAs 和CPPs 的相關性，設計四因素三水平的Box-Behnken 試驗，因素水平見表4、結果見表5。通過Design Expert 10.0.7軟件進行擬合，得到回歸模型M值：Y1=0.031+5×10-4A-5.833×10-4B+1.667×10-4C+8.917×10-4D+5×10-4AB+5×10-4AC -1×10-3AD+1×10-3BC+7.5×10-4BD+2×10-3CD+1.642×10-3A2+1.017×10-3B2-1.608×10-3C2+7.767×10-3D2，（r=0.949 3）；總固形物：Y2=11.90+1.45A+2.85B+0.63C-0.049D-0.84AB-0.65AC-1.77AD+0.46BC-0.54BD+0.64CD-8.883×10-3A2-2.41B2-0.58C2+1.35D2（r=0.867 8，RAdj2=0.735 7）。方差分析見表6，由表6 可知D 對抗氧化能力具有統計學意義（P＜0.000 1），B 對總固形物質量具有統計學意義（P＜0.000 1）；BD 與CD 對抗氧化能力影響稍強，AB 與AD 對總固形物質量影響稍強。三維響應面圖見圖1～2。由圖1可知，隨著溫度的上升抗氧化能力上升明顯，其余參數無明顯變化。由圖2可知，隨料液比、溫度的上升固形物含量上升，當提取次數達到一定程度時，固形物含量上升緩慢。

圖1 AOE的M三維響應面圖

圖2 AOE總固形物質量三維響應面圖

表4 AOE Box-Behnken因素水平

表5 AOE Box-Behnken試驗設計

表6 AOE Box-Behnken試驗設計分析結果

2.7 設計空間的建立、優化及驗證

通過Design Expert 10.0.7 軟件建立顯著影響因素B、D的設計空間，將優化目標定位總固形物質量＞11 g（＞44%），M＞0.032。但由于模型預測值與真實值之間存在一定的誤差，可能導致設計空間的邊界具有不確定性，故在定義設計空間參數時加入置信水平α=0.05 的置信區間，結果應用Overlay Plot 展示，將A 固定為高水平，在不同水平C 下的設計空間，結果見圖3。可以看出，C在2 h設計空間的自由度最大。將2個設計空間重疊，圖4中交叉區域即為操作空間。結合實際情況選取3個操作空間內的優選點進行放大10倍驗證實驗，3個驗證點的選取及驗證

圖3 AOE設計空間隨提取次數和提取溫度的變化趨勢

圖4 AOE設計空間圖

注：*P＜0.05,**P＜0.01。實驗結果見表7。其中抗氧化活性測試RSD＜3%，總固形物質量RSD＜5%。由表7可知，預測值與實際值較為接近，表明該模型的適應性較好。

表7 AOE設計空間試驗結果驗證

3 討論

本研究以QbD 理念為基礎，采用信息熵理論綜合多個評價指標，對AOE 工藝進行優化。枸杞子中含有豐富的黃酮、類胡蘿卜素及綠原酸等物質和多糖，由于不同工藝制備的提取物中這些天然抗氧化劑的含量不同，進而提取物表現出不同的抗氧化活性。因此，筆者選取FRAP測試、ABTS自由基清除能力和OH·清除能力來測試不同提取物的抗氧化活性，并通過信息熵理論對3 種抗氧化測試進行綜合評價。通過1 個指標綜合反映提取物的M，與總固形物質量一同作為CQAs。采用24-1分式析因設計篩選CPPs。從表3 可以看出，提取溫度對于抗氧化活性具有統計學意義（P＜0.01），料液比和提取次數對于固形物具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。因此，將料液比、提取次數、提取溫度作為CPPs。CQAs 和CPPs 之間數學模型的建立可以反映出兩者的相互關聯，揭示不同CPPs 對CQAs 所造成的影響，增強對工藝過程的理解，為之后的工藝優化和控制策略建立提供參考。

通過Box-Behnken 設計建立CPPs 對CQAs 的數學模型，擬合出兩者之間關系的響應面，以此描述CPPs對CQAs的影響效應。由表5～6可知，M和總固形物質量這兩種模型具有統計學意義（P＜0.000 1，P＜0.00 1）；失擬項的P值均大于0.05，表明兩種模型均可以接受；r分別為0.949 3 和0.867 8，RAdj2分別為0.898 5 和0.735 7，表明兩種模型與數據擬合度良好。其中，提取溫度對M的影響十分顯著，其余參數并無顯著影響；提取次數對總固形物質量具有顯著影響，而料液比與提取時間之間的交互作用對總固形物質量的影響相對較弱。根據兩個回歸方程進行繪圖分析，由圖1～2 可知，提取溫度對應的曲面坡度較陡，提取次數對應的曲面坡度比較平緩，表明提取溫度對信息熵M值的影響顯著；隨著提取次數的增加，總固形物質量增加；總固形物質量隨料液比的增加也有所上升，而隨提取溫度變化不明顯。在析因分析和方差分析中均顯示，提取溫度對抗氧化能力有顯著性影響，提取次數對總固形物質量有顯著影響。在枸杞子水提物中，主要成分為枸杞多糖，其次為酚類、黃酮類等物質，這些物質具有較高的抗氧化活性；其擴散系數隨溫度升高而升高，進而使水提物的抗氧化活性增強[35-39]。有研究顯示，在料液比達到1∶20時，枸杞多糖的提取率達到最大并趨于平緩。本研究中料液比遠遠小于1∶20，枸杞多糖的溶解度比較低，而枸杞水提物中多糖的質量分數高達97.54%，因此，增加提取次數可以顯著提升總固形物的含量[39-40]。

設計空間被定義為能夠保障產品質量的輸入變量和工藝參數的多維空間組合與相互作用，并不是一個固定的參數[41]。由圖3可以看出，兩者皆是在料液比為1∶8、提取時間2 h 時表現出最大的自由度。因此，將兩者重疊，交叉區域為同時滿足2種條件的設計空間，即圖4中交叉區域。通過放大10倍對設計空間的驗證表明，基本符合優化目標。設計空間的準確與否取決于CQAs 和CPPs 之間的數學模型是否準確，建立更加精準的數學模型直接影響設計空間是否可靠。因此，選用合適的工具預測CQAs 與CPPs 在工藝過程中的質量傳遞規律，可以構建出更加穩定、精確的設計空間。此外，設計空間并不是穩定不變的，設計空間的建立是一個長期的過程，在產品的整個生命周期中，隨著工藝研究的不斷深入，所獲取的新的知識可被用來不斷改進設計空間[42]。

控制策略是在對當前產品和過程充分理解的基礎上，制定出一套行之有效的控制方案，其目的是保障產品的質量和性能。上述提取工藝研究表明，提取次數和提取溫度這2 個CPPs 對提取工藝有顯著性影響，對CPPs 的有效控制是保證產品質量穩定、可控的關鍵。在提取過程中提取次數對總固形物的含量影響較大，可適當增加提取次數來獲得較多的總固形物。圖2 表明，當提取次數較低時，可適當增加料液比來補償提取液中總固形物質量的下降。而提取溫度的控制，對于制備物體外抗氧化活性的影響較為顯著，可以采用控溫性能良好的設備對溫度進行實時監控。