基于網絡藥理學探討華蟾素注射液治療結直腸癌的作用機制*

徐玲艷，于天怡，石美智，陳君君，邢婷玉，徐曉紅，劉 盈，韓永龍，張 鳳，姜 波△

（1.上海交通大學附屬第六人民醫院，上海 201306；2.上海長征醫院，上海 200003）

結直腸癌為臨床常見消化道腫瘤，發病率和死亡率均僅次于乳腺癌和肺癌，位居第3位［1］。外科手術是治療結直腸癌的首選方案，但化學治療（簡稱化療）仍是晚期結直腸癌的主要治療方式［2-3］。隨著靶向治療、免疫治療的加入，晚期結直腸癌患者的生存率提升［4］。中藥作為中國醫藥資源的寶庫，在癌癥的治療中仍占有一席之地。中藥制劑通過調節多個信號通路可直接發揮抗腫瘤作用，還對化療引起的一系列不良反應有緩減效果，能起到增效減毒的作用。華蟾素注射液（HCSI）是以蟾皮為主要原料提取精制而成的水溶性制劑，是第1個獲得美國國立癌癥研究所（NCI）資助進行臨床研究的抗腫瘤中藥注射液，廣泛應用于原發性肝癌、胃癌、肺癌、結直腸癌、胰腺癌等多種中晚期腫瘤的治療，特別是對含草酸鉑方案化療失敗的晚期結直腸癌患者療效顯著［5］。目前，已從蟾皮中分離獲得超過100個單體化合物，其化學成分主要有蟾蜍內酯（蟾毒配基類、蟾蜍毒素類）、蟾毒色胺類、多肽類、核苷類、氨基酸類等。華蟾素注射液中的水溶性生物堿及微量的脂溶性蟾毒內酯類毒性成分被認為是其主要的兩類化學活性成分［6-7］。隨著對華蟾素有效成分研究的不斷深入，為探討其藥效作用機制，系統研究華蟾素注射液的化學活性成分非常必要，對于研究中藥復方作用靶點、用藥規律意義深遠。本研究中采用網絡藥理學方法，綜合分析藥物-疾病-基因-靶點間的關系，剖析華蟾素注射液“多基因、多靶點”的作用特點［8-9］；利用網絡藥理學技術對篩選出的華蟾素注射液作用靶點進行聚類分析，從多個層面深入探討其作用機制，全面分析其作用靶點、生物過程及信號通路；并使用計算機輔助軟件對華蟾素注射液的主要活性成分與關鍵靶標蛋白進行模擬對接，以闡明其治療結直腸癌復雜的作用機制，為華蟾素注射液治療結直腸癌的深入研究提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：Orbitrap Fusion Lumos型液質聯用高分辨質譜儀（美國Thermo公司）；UNIVERSAL 32R型臺式冷凍離心機（德國Hettich公司）；ULT1786-3-V37型超低溫冰箱（美國Revco公司）。

試藥：華蟾素注射液（安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，批號為190101-2）；DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；其余試劑均為分析純。

細胞：人克隆結腸腺癌細胞Caco-2細胞（中國科學院細胞庫）。

1.2 數據庫與軟件

Canonical SMILES結 構：PubChem網 站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。

數據庫：活性成分靶點數據庫（SwissTargetPrediction，http：//www.swisstargetprediction.ch/）；蛋白質數據庫（UniProt，https：//www.uniprot.org/）；蛋白質結構數據庫（PDB，http：//www.rcsb.org/）；基因信息數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）；疾病靶點數據庫（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）；Drugbank數據庫（https：//go.drugbank.com/）；生物學信息注釋數據庫（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/）。

軟件：蛋白質-蛋白質相互作用分析平臺（String，https：//string-db.org/）；生物信息云平臺（OmicShare，https：//www.omicshare.com/）；網絡分析及作圖軟件［可視化軟件Cytoscape 3.7.2，Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）］；ChemBioOffice 2014軟件；分子對接相關軟件（Auto-Duck Tools，ChemBio 3D，PyMOL，MOE）。

1.3 方法

活性成分-靶點網絡構建：從文獻中查閱目前華蟾素注射液已明確的主要化學成分，從PubChem數據庫獲得活性成分標準canonical SMILES結構式，導入SwissTargetPrediction數據庫進行活性化合物靶點預測，默認選擇“Homo sapiens”，輸入化合物字符串SMILES，提交、預測、篩選與華蟾素注射液活性化合物相關的作用靶點。通過UniProt數據庫檢索，限定物種為“人”，將檢索得到的所有靶點蛋白校正為其標準名稱。在Gene-Cards數據庫、TTD數據庫、Drugbank數據庫檢索結直腸癌相關靶基因，將以上3個數據庫獲取的結直腸癌靶基因與華蟾素注射液靶基因輸入Venny 2.1.0軟件，取交集作為華蟾素注射液抗結直腸癌的關鍵靶點，將上述靶點及華蟾素注射液主要化學成分導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建中藥-活性成分-疾病靶點網絡。

華蟾素注射液抗結直腸癌靶蛋白互作網絡（PPI）構建：將華蟾素注射液抗結直腸癌靶點導入String平臺構建PPI，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，自定義相互作用閾值“confidence=0.97”，其他參數為默認值。將PPI導入Cytoscape 3.7.2軟件，利用“Network Analysis”功能計算各網絡節點的度值、介數、最短路徑等拓撲參數，上述參數的值越大表明該節點在網絡中的位置越重要。選取網絡中3個拓撲參數均較大且在均值以上的靶點作為華蟾素注射液抗結直腸癌的關鍵靶點。

華蟾素注射液抗結直腸癌靶點的基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析：將華蟾素注射液抗結直腸癌靶點輸入OmicShare和DAVID 6.8平臺，分別進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，依據P<0.001和P<0.05篩選富集的生物功能及信號通路。

華蟾素注射液抗結直腸癌核心靶點的分子對接：在PDB數據庫搜索華蟾素注射液抗結直腸癌核心靶點的蛋白晶體結構，借助PyMOL軟體將核心靶蛋白與原配體分離，同時去除核心靶蛋白的水分子、磷酸根及多余的非活性配體。將核心化學成分的二維（2D）結構導入ChemBio 3D軟件后進行MM2能量最小化優化，以mol2格式保存。將核心靶蛋白、原配體、化合物三維（3D）結構統一導入MOE軟件，利用“Site Finder”功能找出活性口袋，進行核心靶蛋白與目標化合物的分子對接。

細胞培養與華蟾素注射液測定：將Caco-2細胞培養在T75方瓶中，培養液為DMEM培養基、10% FBS、1%雙抗溶液（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置37℃、5%CO2細胞培養箱中培養4～6 d傳代，直到細胞數量足夠，以1×105個/mL接種于6孔板。48 h后每孔中加入含華蟾素注射液的培養基2 mL，分為空白組及1.0%，0.3%，0.1%（V/V）華蟾素注射液組，每組設3個重復。培養48 h后棄去上清液，用冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入100 μL十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液裂解細胞，提取蛋白，經還原烷基化、丙酮沉淀后酶解過夜。肽段除鹽后加入10 μL 0.5%甲酸-5%乙腈溶液重懸，-80℃冰箱保存備用。取6 μL肽段樣品，置Orbitrap Fusion Lumos型液質聯用高分辨質譜儀分析。色譜條件：色譜柱為New Objective self-packed C18analytical PicoFrit column柱（40 cm×75 μm，9 μm）；流動相A為0.5%甲酸-2%乙腈溶液（V/V），流動相B為0.5%甲酸-80%乙腈溶液（V/V），梯度洗脫（0～60 min時5%B→50%B）；流速為300 nL/min。質譜條件：全掃描模式分辨率設置為120000，質荷比（m/z）為350～1500；數據非采集（DIA）模式掃描分辨率設置為30000，AGC target設置為1×e6，maximal IT設置為54 ms。DIA原始數據文件使用Spectronaut X軟件進行搜庫分析。

2 結果

2.1 活性成分

華蟾素注射液為蟾皮的水提取物，化學成分復雜，目前已從蟾皮中分離獲得超過100個單體化合物，主要包括蟾蜍二烯羥酸內酯類、吲哚生物堿類、蟾蜍環酰胺類、小分子環肽類、核苷類等。根據文獻［10-12］報道，將篩選得到的63個化合物依次輸入PubChem數據庫，獲取相關化合物信息，詳見表1。

表1 華蟾素注射液中活性化合物信息Tab.1 Information of active compounds in Huachansu Injection

續表1華蟾素注射液中活性化合物信息Continued Tab.1 Information of active compounds in Huachansu Injection

2.2 抗結直腸癌作用靶點及主要成分預測

通過SwissTargetPrediction數據庫預測共得到華蟾素注射液化合物靶點978個，從數據庫中獲取結直腸癌疾病靶點共10495個。其中，TTD數據庫19個，Drugbank數據庫48個，GeneCards數據庫10428個。將華蟾素注射液活性成分靶點與結直腸癌疾病靶點導入Venny 2.1軟件，去重后得到25個共有靶點，詳見圖1。利用Cytoscape 3.7.2可視化軟件繪制華蟾素注射液治療結直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點網絡圖，每個參與互作的活性成分節點用一個圓圈表示，圓圈面積越大、顏色越深表示其度值越大，詳見圖2。篩選化合物度值大于5的節點，按度值大小對華蟾素注射液的活性成分進行排序，共篩選出26種核心活性成分，詳見表2。

表2 華蟾素注射液核心活性成分拓撲學性質Tab.2 Topological properties of the core active ingredients of Huachansu Injection

圖1 華蟾素注射液活性成分靶點與結直腸癌疾病靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of active ingredients of Huachansu Injection and targets of CRC

圖2 華蟾素注射液抗結直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點網絡Fig.2 TCM-active ingredients-disease targets network of Huachansu Injection against CRC

2.3 抗結直腸癌靶蛋白PPI

用篩選出的25個蛋白在String數據庫中考察蛋白相互作用時，發現有8個孤立蛋白。將String得到的蛋白互作結果導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析，按度值大于5排列主要靶點，篩選出華蟾素注射液治療結直腸癌的主要疾病靶點7個。由圖3可知，每個參與互作的蛋白節點用一個圓圈表示，圓圈面積越大代表其度值越大，相互作用連線越粗代表其介數越大，圓圈周線越粗代表其路徑越短。PPI中共有17個節點、34條相互作用連線，平均度值為2.72，平均介數為4.89×10-2，平均最短路徑為3.43×10-1，經節點的度值、介數、最短路徑3個拓撲參數篩選，在網絡中較大的7個核心靶點分別為信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、熱激蛋白90α家族成員1（HSP90AA1）、表皮生長因子（EGFR）、激酶插入區域受體（KDR）、碳酸酐酶9（CA9）、Rho相關蛋白激酶1（ROCK1）、細胞間質上皮轉換因子（c-MET），詳見表3。

表3 華蟾素注射液抗結直腸癌核心靶點及其拓撲參數Tab.3 Core targets and their topological parameters of Huachansu Injection against CRC

圖3 華蟾素注射液作用靶點的PPIA.Seventeen target proteins B.Seven target proteinsFig.3 PPI network of target of Huachansu Injection

2.4 抗結直腸癌靶點的GO功能富集分析

利用DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO功能富集分析，依據P<0.001篩選出GO條目262個，其中生物過程（BP）223個，分子功能（MF）24個，細胞組成（CC）15個。利用OmicShare云平臺對7個關鍵靶點進行GO功能富集分析，結果顯示，BP主要涉及發育過程、生物過程的調節、代謝過程、刺激反應等，MF和CC主要涉及結合過程、催化活性、信號轉導活性、分子功能調節、細胞膜等。詳見圖4和圖5。

圖4 華蟾素注射液抗結直腸癌靶點的GO功能富集分析二級分類柱狀圖Fig.4 Histogram of the second classification of GO function enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

圖5 華蟾素注射液抗結直腸癌靶點的GO功能富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of GO function enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

2.5 抗結直腸癌靶點的KEGG通路富集分析

依據P<0.05篩選7個關鍵靶點的KEGG通路，主要有癌癥途徑（pathways in cancer）、氮代謝（nitrogen metabolism）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥的中心碳代謝（central carbon metabolism in cancer）、黏著斑（focal adhesion）、大鼠肉瘤病毒（Ras）信號通路（Ras signaling pathway）、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路（HIF-1 signaling pathway）、麻疹（measles）等29條，詳見表4。由圖6可知，目標靶基因涉及代謝、細胞過程、器官系統、疾病等。上述前20條信號通路的氣泡圖見圖7，以富集因子（RF）、P值及調控通路上的基因個數衡量KEGG富集程度，其中氣泡顏色代表P值的大小，RF代表富集程度的大小，氣泡大小代表該通路中目標基因的多少。可見，P值偏小為癌癥中的蛋白多糖、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、腫瘤中的microRNA、黏著斑、癌癥途徑、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、癌癥的中心碳代謝、人巨細胞病毒感染、非小細胞肺癌（NSCL）、黑色素瘤、胰腺癌、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉導、黏合連接、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、前列腺癌、HIF-1信號通路、FoxO信號通路。通過使用預測目標靶蛋白在結直腸癌通路的富集分析發現，上述關鍵目標蛋白在結直腸癌的治療中發揮重要作用，詳見圖8。

圖6 華蟾素注射液抗結直腸癌靶點的KEGG通路富集分析數目統計圖Fig.6 Statistical chart of KEGG pathway enrichment number of targets of Huachansu Injection against CRC

圖7 華蟾素注射液抗結直腸癌靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of targets of Huachansu Injection against CRC

圖8 華蟾素注射液作用的靶蛋白在結直腸癌通路的富集Fig.8 Enrichment of target proteins of Huachansu Injection in the CRC pathway

表4 KEGG通路富集分析信號通路Tab.4 Signal pathways of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 對結直腸癌細胞中靶點蛋白的調節作用

不同濃度的華蟾素注射液與Caco-2細胞共同培養后，采用Orbitrap Fusion Lumos型液質聯用高分辨質譜儀相對定量Caco-2細胞中7種主要目標靶點蛋白。結果顯示，1.0%（V/V）濃度的華蟾素注射液對STAT3，EFFR，HSP90AA1蛋白均有顯著抑制作用（P<0.05）。詳見圖9。

圖9 華蟾素注射液對結直腸癌細胞中靶點蛋白的調節作用Note：Compared with those in the blank control group，*P<0.05.Fig.9 Regulation of Huachansu Injection on the target proteins in Caco-2 cells

2.7 抗結直腸癌的核心靶點分子對接

篩選PPI中度值排名靠前的核心靶點蛋白，從PDB數據庫中獲得核心靶蛋白的蛋白配體復合物，利用AutoDuck Tools和PyMOL軟件將蛋白除水、除配體，導入MOE軟件，將核心靶蛋白與華蟾素注射液排名靠前且經Chem-Bio 3D結構優化的活性化合物進行分子對接，評價活性化合物與靶蛋白之間的結合活性，根據其結合能大小篩選出華蟾素注射液治療結直腸癌的潛在核心化合物，分子對接結合能低于-5 kcal/mol為結合能力較好。模擬對接的最終GBVI/WSA打分及相互作用分析結果顯示，Bufalin與STAT3（PDB ID為6NJS）的最佳結合能為-6.0649 kcal/mol，Bufalin與HSP90AA1（PDB ID為1BYQ）的最佳結合能為-6.2610 kcal/mol，Cinobufagin與EGFR（PDB ID為5UG9）的 最 佳 結 合能 為-6.1388 kcal/mol，Cinobufagin與KDR（PDB ID為1YWN）的最佳結合能為-6.8075 kcal/mol。分子對接圖見圖10。

圖10 華蟾素注射液主要活性成分與核心靶點蛋白分子對接三維圖和二維圖A1，A2.Bufalin-STAT3 B1，B2.Bufalin-HSP90AA1 C1，C2.Cinobufagin-EGFR D1，D2.Cinobufagin-KDRFig.103D and 2D diagrams of molecular docking of main active ingredients of Huachansu Injection and key target proteins

3 討論

華蟾素注射液作為一種臨床療效確切的抗腫瘤中藥注射液，在晚期結直腸癌的治療中發揮著重要作用［13-14］，其化學成分復雜，主要是蟾毒配基類、蟾蜍毒素類、蟾毒色胺、核苷類、多肽類、氨基酸類等。明確其發揮藥理作用的活性物質是一項繁雜的工作。WEI等［15］考察了華蟾素注射液中的蟾蜍二烯內酯類、生物堿類、核苷類、多肽類對肝癌細胞BEL-7402、胃癌細胞BGC-823的抗癌活性，結果顯示，蟾蜍二烯內酯類具有最強的抗腫瘤活性，其次是多肽類，生物堿類幾乎沒有抗癌活性。KONG等［16］的研究顯示，生物堿類成分蟾蜍噻嚀通過抑制JAK2/STAT3通路而誘導肝癌細胞自噬發揮華蟾素注射液抗腫瘤的作用。本研究中通過網絡藥理學方法，系統分析了華蟾素注射液治療結直腸癌的中藥-活性成分-疾病靶點網絡結構關系，發現華蟾素注射液治療結直腸癌是各類活性物質綜合作用的結果，處于核心藥理作用地位的化學活性物質為蟾蜍二烯內酯類，與文獻［7］報道的結果一致。

本研究中通過網絡藥理學方法深入研究了華蟾素注射液活性成分靶點，重點分析了關鍵靶點及其富集的生物過程、信號通路，發現華蟾素注射液治療結直腸癌主要作用于STAT3，HSP90AA1，EGFR，KDR，CA9，ROCK1，c-MET等核心關鍵靶點，參與發育過程、生物過程的調節、代謝過程、刺激反應等生物過程。關鍵靶點富集的通路主要有癌癥途徑、氮代謝、癌癥中的蛋白多糖、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥的中心碳代謝、黏著斑、Ras信號通路、HIF-1信號通路、麻疹等，其中癌癥途徑、信號通路的數量最多，如PI3K-Akt，Rap1，Ras信號通路等。華蟾素注射液通過STAT3的持續激活參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、癌變等過程，是該通路中的關鍵轉錄因子，也是目前結直腸癌治療研究的熱點［17-19］。c-Met二聚化和磷酸化，進而抑制激活PI3K/Akt，RAS/MAPK，STAT3/JNK等信號通路，阻止腫瘤細胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成、細胞外基質的降解等過程，實現治療結直腸癌的目的［20-23］。蟾毒靈通過EGFR信號通路改善EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抵抗，能改善臨床腫瘤靶向藥物的耐藥問題，顯著提高癌癥的治療效果［24-25］。

本研究中選取了蟾毒靈、華蟾毒配基與預測排名前4名的靶點蛋白進行分子對接，進一步驗證預測的數據。結果顯示，華蟾素注射液中的蟾毒靈對STAT3和HSP90AA1有較好的結合能力，而華蟾毒配基對EGFR和KDR有較好的結合能力。分子對接驗證了4個目標靶點蛋白華蟾素注射液發揮抗腫瘤作用的地位和重要性，同時液質聯用高分辨質譜測定結果也證實了華蟾素注射液對EGFR，STAT3，HSP90AA1的作用，但對c-MET，CA9，ROCK1，KDR有作用的活性成分還需進一步深入研究。

目前，華蟾素注射液藥理活性成分篩選的依據主要依賴化學分離、液相色譜-四極桿飛行時間質譜串聯質譜（LC-QTOF/MS）等體外方法研究的結果。蟾毒靈、華蟾毒配基和酯蟾毒配基是華蟾素注射液中含量較高的化合物，為2020年版《中國藥典（一部）》中質量控制的標志性物質，是入血成分體內藥代動力學研究最多的活性成分［26］。而其他類化學成分因受到儀器設備精確度、靈敏度等條件的限制，無法準確定量臨床劑量下其體內活性成分的濃度，迄今鮮有華蟾素注射液多類活性成分入血定性、定量的綜合研究，故本研究中的預測性研究仍使用文獻已鑒定的體外化學活性成分。

綜上所述，華蟾素注射液治療結直腸癌具有多成分、多靶點、多通路的優勢，后續將對網絡藥理學的預測結果進行生物學實驗驗證，重點圍繞華蟾素注射液對EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、結直腸癌模型PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路展開研究，檢驗預測結果的準確性和可靠度。本研究所得結論建立于數據庫及網絡藥理學統計技術，可為進一步的實驗研究奠定基礎和提供理論依據。