液相色譜串聯質譜法測定大鼠血漿中反式-橙花叔醇質量濃度*

佟彬良，遲玉乾，顏 文，趙夢然，張 卓，周春華△

（1.河北醫科大學第一醫院藥學部，河北 石家莊 050031；2.河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017）

橙花叔醇是源于刺人參根莖、茶樹、枇杷葉等的倍半萜烯化合物，存在于多種植物和花卉的精油中。反式-橙花叔醇是黃檀屬植物降香黃檀揮發油的主要活性成分［1-4］，具有抗氧化、抗微生物、抗生物膜、抗潰瘍、增強皮膚滲透性、抗腫瘤、抗損傷、抗炎等生物活性及體外抗寄生蟲活性［5-10］，同時表現出抗膽堿酯酶、鎮痛、抗炎、抗焦慮活性，故可將其作為治療阿爾茨海默病的潛在植物化學物質［11］。橙花叔醇可通過靶向Toll樣受體4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號傳導抑制炎性反應通路而改善大鼠的心臟功能［12］，其脂質體與環磷酰胺合用可減輕神經毒性作用［13］，與氟康唑合用可增強抗真菌作用［14］。其結構中含有3個雙鍵，包括順式和反式2種構型，順式/反式比為40/60。目前，單一構型橙花叔醇的藥代動力學（PK）性質尚不清楚。本研究中建立了測定大鼠血漿中反式-橙花叔醇質量濃度的液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法，為其PK研究提供依據。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB SCIEX 3200 QTRAP?LC-MS/MS System（美國Sciex公司），配有Analyst 1.6.3數據處理軟件；Sartorius BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；KW-250E型超聲波清洗儀（昆州市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；SMART-P型超純水器（上海力新儀器有限公司）。

1.2 試藥

反式-橙花叔醇（trans-nerolidol，化學分子式C15H26O，相對分子質量222.37，上海源葉生物科技有限公司，批號A19O7R2317，純度95%）；磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，北京索萊寶生物科技有限公司，批號321A023，純度99%）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司，規格為每支12500 U∶2 mL，國藥準字H32022088，批號152101008A）；水為實驗室自制純凈水。

1.3 動物

雄性Sprague-Dawley（SD）遠交群大鼠，體質量200 g，由河北省實驗動物中心提供（動物實驗許可證號為SYXK<冀>2020-002）。實驗前12 h/12 h明暗交替適應性飼養1周。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Synergi fusion-RP C18柱（50 mm×3.0 mm，4 μm）；流動相：乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液（40∶60，V/V）；流速：400 μL/min；柱溫：30℃；進樣量：40 μL；分析時間：3.0 min。

2.1.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應監測模式（MRM）；噴霧電壓：5500 V；溫度：650℃；霧化氣壓力：414 kPa；加熱氣壓力：448 kPa；氣簾氣壓力：172 kPa；解簇電壓、碰撞能量和監測離子對反式-橙花叔醇分別為34 V，15 eV，221.2/135.2，內標磺胺甲噁唑分別為40 V，31 eV，254.1/108.1。反式-橙花叔醇和磺胺甲噁唑的化學結構、產物離子質譜圖見圖1。

圖1 化學結構和產物離子質譜圖A.Trans-nerolidol B.SulfamethoxazoleFig.1 Chemical structures of trans-nerolidol，sulfamethoxazole and MS/MS spectra of products

2.2 溶液制備

取反式-橙花叔醇對照品適量，精密稱定，加乙腈制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液；加乙腈稀釋，制得質量濃度分別為0.025，0.05，0.25，1，2，5，10，20，50，100 μg/mL的系列標準工作液。

取磺胺甲噁唑對照品適量，精密稱定，加乙腈制成質量濃度為100 μg/mL的內標貯備液；加乙腈稀釋，制得質量濃度為1 μg/mL的內標工作液。

2.3 給藥與血樣采集［15］

適應性飼養1周后，選擇體質量相近、健康狀況良好的雄性大鼠6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給藥，劑量為50 mg/kg，分別于給藥后10，20，30 min及1，2，3，4，6，8，12 h時在眼眥后靜脈叢采血，使用肝素處理后的離心管采集血液約0.3 mL，離心（轉速4500 r/min）5 min，取上清液，轉移至另一離心管中，凍存待測［1，16-17］。

2.4 血漿樣品處理

取大鼠待測/空白血漿50 μL，置離心管，加乙腈20 μL、內標工作液20 μL、乙腈200 μL，渦旋混勻1 min，離心（轉速為14000 r/min）10 min，取上清液100 μL，進樣分析。

2.5 方法學考察

標準曲線建立與定量下限確定：取空白血漿50 μL，置離心管中，加反式-橙花叔醇系列標準工作液20 μL，制成質量濃度分別為0.01，0.02，0.1，0.4，0.8，2，4，8，20，40 μg/mL的系列血漿標準溶液，以待測物質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，權重因子選擇1/X2，以最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程Y=0.00639X-0.00121（r=0.9972，n=10）。結果表明，反式-橙花叔醇血漿檢測質量濃度在0.01～40 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，定量下限為0.01 μg/mL。

專屬性試驗：制備不同空白大鼠血漿樣品、加入反式-橙花叔醇稀釋至0.01 μg/mL的空白大鼠血漿樣品、灌胃給藥3 h后的大鼠血漿樣品，平行6份。按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。結果反式-橙花叔醇、磺胺甲噁唑保留時間分別為1.41 min和1.14 min，血漿內源性物質對樣品無明顯干擾，表明方法專屬性良好。LC/MS-MS圖見圖2。

圖2 專屬性試驗液相色譜串聯質譜圖A.trans-nerolidol B.SulfamethoxazoleA1，B1.Blank plasma samples of rats A2，B2.Blank plasma samples of rats adding the trans-nerolidol diluted to the mass concentration of 0.01 μg/mL A3，B3.Plasma samples after the intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol for 3 hFig.2 LC-MS/MS chromatograms of the specificity test

精密度試驗：在連續3 d內重復制備標準曲線樣品、6份4種濃度的質控樣品，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。結果見表1。

表1 大鼠血漿樣品中反式-橙花叔醇的精密度試驗結果、提取回收率和基質效應（n=6）Tab.1 Results of the precision test，extraction recovery test and matrix effect of trans-nerolidol in plasma samples of rats（n=6）

提取回收試驗：取精密度試驗項下6份質控樣品及提取后的空白基質制備的相應濃度的血漿樣品，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。結果見表1。

基質效應：制備提取后的空白基質制備的相應濃度的血漿樣品、水代血漿樣品，重復6份，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。結果待測物和內標的基質效應分別為93.30%～97.51%和92.20%，此方法基質效應均滿足2020年版《中國藥典》9012指導原則要求［18］。結果見表1。

殘留效應：取標準曲線定量下限樣品、空白血漿樣品，平行6份，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定，計算絕對殘留。結果空白血漿中反式-橙花叔醇的殘留峰面積與定量下限峰面積的比值均低于20%，空白樣品中內標磺胺甲噁唑的殘留峰面積與上述質控血漿樣品內標峰面積的比值均低于5%，表明方法殘留效應符合要求。

稀釋可靠性：配制質量濃度為80 μg/mL的含藥空白血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍和20倍，平行6份，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。計算每個稀釋倍數濃度測定值與理論濃度的比值［19］，結果稀釋后樣品的準確度和精密度均在±15%范圍內。

穩定性試驗：制備血漿標準曲線樣品及6份質控樣品，考察3次凍融循環、室溫放置8 h、處理后室溫放置8 h及凍存14 d的血漿樣品的穩定性。按2.4項下方法處理，按2.1項下條件測定。結果經過3次凍融循環，相對標準偏差（RSD）為5.8%～8.4%，相對誤差（RE）為-5.20%～7.30%；經 過 短 期8 h放 置，RSD為4.60%～7.40%，RE為-7.30%～6.50%；處理后室溫放置8 h，RSD為4.50%～7.30%，RE為-6.30%～7.30%；放置14 d后，RSD為5.70%～8.30%，RE為-5.50%～7.50%，表明反式-橙花叔醇穩定性良好。

2.6 PK研究

按2.4項下方法處理含藥血漿樣品，按2.1項下條件測定，血藥濃度-時間曲線見圖3。采用PKSolver 2.0軟件分析，利用非房室模型計算主要PK參數。結果見表2。

圖3 大鼠灌胃給藥50 mg/kg反式-橙花叔醇后血藥濃度-時間曲線Fig.3 Blood concentration-time curve after the intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol in rats

表2 大鼠單次灌胃給藥50 mg/kg反式-橙花叔醇的藥代動力學參數Tab.2 PK parameters after the single intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol in rats

3 討論

3.1 質譜條件選擇

SAITO等［20］利用氣相色譜-質譜（GC-MS）法選擇監測質荷比（m/z）為161.0的離子檢測模式。HE等［15］對質譜條件進行優化時，利用選擇離子檢測模式，并選擇橙花叔醇脫去一分子水后的質子化離子，m/z為205.0作為監測離子。優化質譜條件時發現，一級質譜圖中m/z為221.2時離子豐度最高且穩定，因此選定該m/z作為待測物的分子離子峰。產物離子對選擇時，m/z為221.2/81.1和221.2/135.2的兩組離子對豐度較高。結果顯示，監測離子對m/z為221.2/135.2時檢測靈敏度高。選擇反應檢測模式噪音和干擾更少，靈敏度與信噪比更高，尤其適用于復雜的基質背景高的樣品。

3.2 色譜條件選擇

參考文獻［15］，選擇色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，分析時間14.5 min。結果流動相消耗多，分析時間長。其中，順式與反式-橙花叔醇分離度較低，約為1.2，可能有基質效應，降低了響應值［21］；且橙花叔醇出峰時間過長，峰形展寬。本研究中選擇色譜柱（50 mm×3.0 mm，4 μm），流速400 μL/min，分析時間3 min。節約了時間和流動相，且分離效果好，峰寬更窄。

相比文獻［15］選擇的甲醇-水（含0.1%甲酸）流動相系統，本研究中選擇乙腈作為流動相系統有機相，也提高了內標和待測物的響應值。流動相系統的水相中額外加入乙酸銨，內標和反式-橙花叔醇的峰形變好、響應值變高。最終選擇乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液（40∶60，V/V）進行等度洗脫。

3.3 內標選擇

HE等［15］選擇地西泮作為內標，其與橙花叔醇在同一體系下的色譜行為差異偏大，表現在保留時間相差較多。SAITO等［20］采用GC-MS法分離時，其內標尼醇與橙花叔醇響應值差異過大，且色譜圖中干擾峰較多。本研究中選定的內標磺胺甲噁唑在該色譜條件下保留時間與待測物相近，在質譜正離子模式下響應良好，且內標磺胺甲噁唑和待測物峰面積的匹配性較好。

3.4 樣品前處理方法的選擇

HE等［15］考察了固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）及蛋白沉淀（PP）的方法，發現液液萃取溶劑為乙酸乙酯-正丁醇（9∶1，V/V）時響應值最高。經考察，發現后2種方法靈敏度相當，定量下限均為0.01 μg/mL。故選擇蛋白沉淀法對樣品進行前處理。

3.5 PK

文獻［15］報道大鼠腹腔注射25 mg/kg橙花叔醇在20 min時達最大血藥濃度（8.30 μg/mL），半衰期為0.350 h，約120 min后無法檢測到橙花叔醇。本研究中灌胃反式-橙花叔醇50 mg/kg在30 min時達最大血藥濃度（21.38 μg/mL），半衰期為1.95 h，約8 h后無法檢測到反式-橙花叔醇。腹腔注射給藥和灌胃給藥2種方式藥物吸收程度有較大差異。藥物的順式和反式構型對藥物發揮療效有顯著影響，還會影響代謝器官的代謝作用，順式和反式橙花叔醇代謝可能存在差異。HE等［15］的研究僅確定了異構體的總PK參數。且幾乎沒有證據支持單一異構體的生物活性或毒性，因為它是作為一個整體使用的［22-23］。關于橙花叔醇的文獻報道很少，尤其缺乏對橙花叔醇單一異構體系統的PK研究。國內有氣相色譜法、高效液相色譜（HPLC）法測定橙花叔醇含量的報道［24-25］，但都是測定中藥材及中藥制劑中的含量，未見PK研究。SAITO等［20］建立了測定小鼠血漿橙花叔醇含量的GC-MS法。王秀麗等［26］利用HPLC法測定大鼠血漿中反式-橙花叔醇含量，但并未進行PK研究，且順式和反式-橙花叔醇峰分離效果一般。本研究中優化液相色譜條件，并采用靈敏度更高的質譜檢測方式，系統研究了橙花叔醇單一異構體的PK參數。

綜上所述，所建立的LC-MS/MS法穩定可行，可用于大鼠口服反式-橙花叔醇血藥濃度的測定及PK研究。