高效液相色譜法同時測定醒脾養兒顆粒中6種咖啡酰奎寧酸類成分含量*

朱幫會，李 銀，馬 雪，汪 洋，劉春花，田 琳，李勇軍△

（1.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；4.貴州健興藥業有限公司，貴州 貴陽 550018）

醒脾養兒顆粒由一點紅、毛大丁草、蜘蛛香、山梔茶4味中藥材制備而成，具有醒脾開胃、固腸止瀉、養血安神等功效，臨床廣泛用于治療兒童厭食、腹瀉、腸炎、遺尿等［1-5］。現行質量標準中僅有一點紅和毛大丁草的薄層色譜鑒別、醇溶性浸出物含量規定及顆粒劑常規檢查等項，質量標準較單一，存在質量控制體系不完善、藥效物質基礎不明確等問題。咖啡酰奎寧酸類成分為醒脾養兒顆粒中4味藥材的共有成分，具有抗炎、抗菌、免疫調節等作用［6-7］。目前，關于藥材中咖啡酰奎寧酸類含量測定的研究報道較多，但尚未見醒脾養兒顆粒中此類成分的相關報道。為進一步完善醒脾養兒顆粒質量標準，本研究中建立了同時測定6種咖啡酰奎寧酸類成分含量的高效液相色譜法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher UltiMate 3000型高效液相色譜儀（配有系統控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動進樣器、柱溫箱、溫控樣品室、UV-DAD檢測器及Chromeleon色譜數據工作站），Multifuge X3R型高速冷凍離心機，均購于美國Thermo Fisher Scientific公司；Mettler EL-204型電子天平（精度為萬分之一），Mettler AE-240型電子天平（精度為十萬分之一），均購于梅特勒-托利多儀器<上海>儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；WP-UP-IV-10型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸對照品（批號為wkq21010802），綠原酸對照品（批號為wkq20042702），隱綠原酸對照品（批號為wkq20082705），異綠原酸B對照品（批號為wkq21022206），異綠原酸A對照品（批號為wkq21020306），異綠原酸C對照品（批號為wkq21012501），純度均不低于98%，均購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純，水為超純水；醒脾養兒顆粒（共21批，貴州健興藥業有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：325 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase

2.2 溶液制備

分別精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，加25%甲醇溶解，制成質量濃度分別為0.960，0.978，1.013，0.960，0.966，0.999 mg/mL的對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液適量，置10 mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得質量濃度分別為0.05306，0.08400，0.06857，0.02796，0.01447，0.04115 mg/mL的混合對照品溶液。取樣品2.0 g，精密稱定，置50 mL磨口具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）45 min，放冷，再次稱定質量，加25%甲醇補足減失的質量，離心（轉速為14000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取空白溶液及2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，供試品溶液與混合對照品溶液色譜中各相應色譜峰保留時間一致，各待測成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且空白溶液無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenic acid 4.Isochlorogenic acid B 5.Isochlorogenic acid A 6.Isochlorogenic acid C A.Blank solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，加25%甲醇逐級稀釋，得系列梯度濃度混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。

表2 6種咖啡酰奎寧酸類成分線性關系考察結果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of six caffeoylquinic acids（n=6）

精密度試驗：取樣品（批號為20210117）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件平行進樣6次，記錄峰面積。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C色譜峰峰面積的RSD分別為0.12%，0.11%，0.14%，0.31%，0.25%，0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20210117）6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C平均含量的RSD分別為0.37%，0.32%，0.25%，1.55%，1.57%，0.94%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄6種待測成分峰面積。結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C色譜峰峰面積的RSD分別為0.55%，0.73%，0.88%，1.18%，0.65%，1.30%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20210117）6份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對照品0.1210，0.1740，0.1470，0.05296，0.02648，0.06691 mg，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取21批樣品各2.0 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算各成分含量，結果見表4。可見，21批樣品中6種咖啡酰奎寧酸總含量為0.30291～0.68319 mg/g，平均含量為0.48599 mg/g。

表4 樣品含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of the content determination of six caffeoylquinic acids in the samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法選擇

曾考察超聲和回流2種提取方式，提取效果差異不明顯，故選擇更簡便的超聲提取法。曾考察不同體積分數（25%，50%，75%，100%）的甲醇和乙醇作為提取溶劑時待測成分的峰面積。綜合考慮節省溶劑、環保等因素，以25%甲醇提取時各待測成分的峰面積較大。曾考察不同提取時間（15，30，45，60 min）對提取效果的影響，發現超聲提取45 min時各待測成分的提取率最大，故選擇提取時間為45 min。

3.2 色譜條件優化

曾考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，結果流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液時6種待測成分能在25 min內同時檢測，且待測成分峰形較好，分離度均大于1.5。曾考察不同品牌色譜柱的分離效果，結果ACE Excel 5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）具有較高的柱效，待測成分與雜質峰區分效果明顯。根據DAD全波長掃描結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C均于325 nm波長處有最大吸收。故選擇325 nm作為檢測波長。同時，考察不同柱溫（25，30，35℃）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對待測成分分離度和峰形的影響。結果表明，在固定色譜柱，柱溫分別為25℃和35℃、流速為0.8 mL/min時各峰分離度小于1.5時峰形較差，當柱溫為30℃、流速為1.0 mL/min時各峰分離度均大于1.5，且方法學考察結果符合相關要求。故選擇柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min。

3.3 指標成分選擇

目前，醒脾養兒顆粒在臨床研究多集中于臨床療效與單味藥材的化學成分分離鑒定，對物質基礎與質量評價卻鮮有報道。《國家藥品監督管理局國家藥品標準》WS-10337-（ZD-0337）-2002-2012Z作為目前醒脾養兒顆粒的執行標準，僅有薄層色譜鑒別項，未對含量測定進行相關規定。陶劍美等［8］采用紫外分光光度法對醒脾養兒顆粒中的總黃酮進行測定；舒波等［9］采用高效液相色譜法測定熊果苷、槲皮苷、纈草三酯和乙酰纈草三酯的含量。醒脾養兒顆粒處方藥材中含有黃酮類、香豆素類、咖啡酰奎寧酸類、萜類、木脂素類等多種化學成分［10-13］，成分復雜，其功效往往是多種有效成分共同作用的結果，在優先選擇君藥、臣藥及其他藥味專屬性成分進行含量測定時，方中藥味所含共有成分可能會被忽略。在對質控指標進行探索性研究中，通常以其中一個指標成分作為定性鑒別和定量檢測的對象，但中藥及中藥復方制劑成分種類復雜，只對其中任意1種成分進行檢測不能體現整體性，共有成分通常是反映制劑整體質量控制的指標，故對共有成分進行含量測定具有重要意義。參考文獻［6，14］，咖啡酰奎寧酸類成分作為醒脾養兒顆粒中4味藥材的共有成分，其含量相對較高且較穩定，具有抗菌、細胞保護、免疫調節等良好的藥理活性。故選擇咖啡酰奎寧酸類成分作為醒脾養兒顆粒的含量測定指標。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結果準確可靠、重復性好，可用于測定醒脾養兒顆粒中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 6種成分的總含量，為其質量控制提供試驗依據。