高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方香芍口服液中芍藥苷含量*

丁家昱，韓憲忠△，番 正，夏榮松，袁文霄

（1.重慶市人民醫(yī)院·中國(guó)科學(xué)院大學(xué)重慶醫(yī)院，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016）

腹痛、腹脹、消化不良為臨床多發(fā)病，西藥解痙鎮(zhèn)痛藥物雖有一定止痛效果，但消除伴隨癥狀作用較差，常有口干、心悸、嘔吐惡心等藥品不良反應(yīng)發(fā)生。目前，市場(chǎng)上治療腹痛的中成藥較常見(jiàn)。重慶市人民醫(yī)院以木香、白芍、厚樸、吳茱萸、甘草5味藥材經(jīng)提取、純化工藝，最終制得復(fù)方香芍口服液。初步藥效學(xué)與毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑具有緩解腹痛、脹滿(mǎn)、消化不良、嘔惡厭食的功效，且起效快、療效好、副作用小，市場(chǎng)前景良好。方中白芍具有解痙、肌松、抗菌、保護(hù)消化道、治療潰瘍等作用［1］，其主要有效成分為芍藥苷。本研究中建立了測(cè)定復(fù)方香芍口服液中白芍活性成分芍藥苷含量的高效液相色譜法，以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPA225D型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Waters 2487型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；Simplicity-185型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；SC-04型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111730-201307，含量為97.4%）；復(fù)方香芍口服液（醫(yī)院制劑，編號(hào)分別為S1，S2，S3，規(guī)格為每瓶10 mL）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸二氫鉀溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。精密量取供試品溶液10 μL，按此色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1 A。結(jié)果顯示，芍藥苷峰與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)大于3000。

2.2 溶液制備

精密量取樣品1 mL，90℃水浴蒸至約0.5 mL，用10 mL甲醇溶液洗滌殘余物，洗滌液轉(zhuǎn)入10 mL離心管，離心（轉(zhuǎn)速為3000 r/min）20 min，取上清液，置50 mL容量瓶中，10 mL甲醇洗滌沉淀，同法離心，合并上清液，加甲醇稀釋并定容，搖勻。精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻；用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品12.00 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。按相同處方比例和制備工藝，制備僅缺乏白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1 B和圖1 C。可見(jiàn)，芍藥苷保留時(shí)間為10.58 min，陰性對(duì)照品溶液色譜圖中相應(yīng)位置無(wú)此峰，表明雜質(zhì)及陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾，該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖1.PaeoniflorinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，5，10，15，20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=12543X+89144，r=0.9997（n=5）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.059～1.180 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷峰面積的RSD為1.20%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取樣品（編號(hào)為S1）適量，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷峰面積的RSD為0.83%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，1，2，3 d時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果芍藥苷峰面積的RSD為1.01%（n=4），表明對(duì)照品溶液在室溫下3 d內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（編號(hào)為S1）樣品適量，混勻，依法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷的平均含量為363.80 mg/mL，RSD為0.74%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取芍藥苷對(duì)照品0.75 g，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品濃溶液（質(zhì)量濃度為15.37 mg/mL）。精密量取已知含量的樣品（編號(hào)為S1，質(zhì)量濃度為363.80 mg/mL）1 mL，共9份，分別加入對(duì)照品濃溶液8，10，12 mL，平行3份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（編號(hào)分別為S1，S2，S3）樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批（編號(hào)分別為S1，S2，S3）樣品中芍藥苷含量分別為363.80，368.75，370.55mg/mL，RSD分別為0.73%，1.21%，0.96%。

3 討論

參考文獻(xiàn)［2］及2020年版《中國(guó)藥典（一部）》白芍［3］項(xiàng)下項(xiàng)目，測(cè)定芍藥苷含量時(shí)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。預(yù)試驗(yàn)中，復(fù)方香芍口服液中存在雜質(zhì)峰，未能與芍藥苷峰得到有效分離，嚴(yán)重干擾后者的測(cè)定。參考文獻(xiàn)［4-16］，分別以乙腈-0.1%磷酸溶液［4，6-8，14］、乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（7∶13∶80，V/V/V）［9］、乙腈-0.05%磷酸二氫鉀溶液［10，15］、乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80，V/V）［11］等為流動(dòng)相系統(tǒng)，考察芍藥苷與其他組分的分離效果。綜合考慮，最終確定2.1項(xiàng)下色譜條件，在此條件下芍藥苷與其他組分分離良好。

木香、白芍、厚樸、吳茱萸、甘草組方中含有大量的多糖類(lèi)物質(zhì)，溶液呈膠體狀，不能直接進(jìn)行高效液相色譜分析，其他組分干擾嚴(yán)重。在樣品前處理過(guò)程中，分別考察采用50%甲醇和甲醇作為溶劑，沉淀雜質(zhì)并稀釋樣品，取上清液，濾過(guò)，分別進(jìn)樣測(cè)定，色譜峰分離均較好，但甲醇作為溶劑的雜質(zhì)峰更少。故采用甲醇沉淀及分離多糖類(lèi)物質(zhì)。

曾考察3個(gè)廠家的同類(lèi)型色譜柱，結(jié)果樣品中芍藥苷色譜峰峰形良好，與雜質(zhì)均達(dá)到基線(xiàn)分離，含量測(cè)定結(jié)果基本一致，表明方法對(duì)色譜柱的耐用性良好。

綜上所述，本研究中建立的方法簡(jiǎn)便快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，適用于復(fù)方香芍口服液中白芍的主要活性成分芍藥苷的含量測(cè)定。