三株大興安嶺森林凋落物真菌中次生代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究

甄錦程，司 璐，于洪佳，都婷婷，劉 瑤，單體江，徐利劍*

1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642

真菌物種豐富且可以產(chǎn)生多樣的次生代謝產(chǎn)物，其中包括可以應(yīng)用在醫(yī)藥與農(nóng)藥領(lǐng)域的抗菌化合物[1]。森林凋落物的分解依賴于真菌的多樣性，森林凋落物也被認(rèn)為是真菌的良好棲息地。大興安嶺森林凋落物中的真菌資源豐富，Zhang等[2]在大興安嶺森林凋落物中，發(fā)現(xiàn)6株真菌的提取物具有抗菌活性，在2株真菌中得到4個單體化合物。Qiu[3]在大興安嶺森林凋落物真菌中分離得到了2個具有抗細菌活性的單體化合物。本研究以三株具有抗菌活性的大興安嶺森林凋落物真菌為材料，對其產(chǎn)生的主要抗菌化合物進行分離鑒定，共得到8個化合物(見圖1)，其中有2個化合物為新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物，5個化合物具有抗菌活性。本研究為進一步利用森林凋落物真菌產(chǎn)生的抗菌化合物奠定了基礎(chǔ)。

圖1 化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀(Bruker Avance III 400，德國)；高分辨質(zhì)譜儀(Bruker maXis，美國)；柱層析用硅膠(青島海洋公司，100～300目)；Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare，美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器公司，RE-52AA)；臥式恒溫培養(yǎng)搖床(上海捷呈實驗儀器有限公司，TS-211B)；恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊有限公司，BIC-250)；分析型高效液相色譜(島津企業(yè)管理有限公司，LH-20A)；半制備型高效液相色譜(北京慧德易科技有限公司，QuikSep LC-10)；甲醇等色譜純試劑(北京邁瑞達科技有限公司)；氘代試劑(上海麥克林生化科技有限公司)；金霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 真菌材料

三株真菌分離自大興安嶺森林凋落物樣品，分別為Berkleasmiumsp.SGSF622(GeneBank登錄號：MZ778149)、Oidiodendronsp.SGSF289(GeneBank登錄號：ON171371)和Parapyrenochaetasp.SGSF062(Genebank登錄號：MK192906)，菌株保藏在黑龍江大學(xué)植物病理學(xué)實驗室。經(jīng)活性篩選，三株真菌乙酸乙酯提取物都表現(xiàn)出了抗菌活性。

1.3 真菌的發(fā)酵

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1 000 mL水，滅菌后冷卻備用。將真菌SGSF622接種至90 mm的PDA平板，共接種200個，在25 ℃條件下靜置培養(yǎng)14 d。酵母提取物蔗糖培養(yǎng)基(YES)配方：1 000 mL藍蓋瓶中蔗糖10 g、酵母浸粉2 g、硫酸鎂0.1 g，100 mL水，根據(jù)溶液體積加入適量蛭石，滅菌后冷卻備用。將真菌SGSF289和SGSF062接種至YES培養(yǎng)基，每種真菌接種20瓶，在25 ℃條件下靜置培養(yǎng)14 d。

1.4 提取與分離

真菌培養(yǎng)發(fā)酵結(jié)束后，利用等體積乙酸乙酯提取24 h，重復(fù)3次，減壓濃縮獲得SGSF622提取物3.0 g、SGSF289提取物5.3 g和SGSF062提取物4.8 g。提取物進行正相硅膠柱層析，流動相采用二氯甲烷-甲醇(100∶0、100∶0.5、100∶1、100∶2、100∶3、100∶5、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100)進行洗脫獲得10個組分，記為Fr.1～Fr.10。SGSF622的Fr.2與Fr.3～Fr.4通過Sephadex LH-20柱層析，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫。進一步通過半制備液相，甲醇-水洗脫(0～4 min，10%甲醇；4～55 min，10%→90%甲醇；55～70 min，90%→100%甲醇；70～90 min，100%甲醇)。SGSF622得到兩個化合物：化合物1(2 mg，tR=55 min)、2(2 mg，tR=61 min)。同SGSF622分離過程相同，SGSF289的Fr.3～Fr.4中分離了2個化合物：化合物3(4 mg，tR=26 min)和4(2 mg，tR=22 mg)，SGSF062的Fr.2、Fr.4、Fr.6～Fr.7中分離得到4個化合物：化合物5(4 mg，tR=24 min)、6(2 mg，tR=20 min)、7(3 mg，tR=22 min)和8(2 mg，tR=16 min)。

1.5 抑菌活性測定

利用96孔板測定化合物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。測試菌株包括用青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)BXL015、丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)BLY016、甘藍黑腐黃單胞菌(Xanthomonascampestrus)BLY013、水稻黃單胞菌(X.oryzae)CCTCC AB 91123。其中水稻黃單胞菌來自中國典型培養(yǎng)物中心，其他菌株來自于黑龍江大學(xué)植物病理學(xué)實驗室。采用96孔板微量稀釋法[4]，對化合物1～8進行抗菌實驗。在96孔板上，第1孔加入100 μL的LB液體培養(yǎng)基和2 mg/mL的待測化合物溶液母液100 μL，混合均勻后，在96孔板中進行倍半稀釋，使每孔待測化合物終濃度為1000 μg/mL至0.98 μg/mL，每個濃度3次重復(fù)，28 ℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天后，對細菌培養(yǎng)液渾濁度進行觀察，培養(yǎng)液最澄清的最低化合物濃度為該待測化合物的最低抑菌濃度(MIC)，金霉素作陽性對照，DMSO作陰性對照，空培養(yǎng)基作空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

化合物1白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；HR-ESI-MS：m/z381.054 2[M-H]-(calcd for C21H14ClO5，381.053 5)，推測分子式為C21H15ClO5，其NMR數(shù)據(jù)見表1。經(jīng)文獻查閱，發(fā)現(xiàn)化合物1結(jié)構(gòu)與已知化合物Sch53825的結(jié)構(gòu)最為相近[5]，差異在于化合物1比Sch53825多一個甲氧基信號(-OCH3)δC：57.0，δH：3.57(s，3H)；化合物1的C-1(δ69.3)化學(xué)位移值低場區(qū)移動了7.8 ppm和C-2(δ51.8)化學(xué)位移值高場區(qū)移動了1.1 ppm。在HSQC譜中，H-11與C-11相關(guān)；HMBC譜中，H-11與C-1相關(guān)(見圖2)，確定了甲氧基的位置。綜合上述信息，鑒定該化合物為1-甲氧基-Sch53825。

表1 化合物1的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)數(shù)據(jù)(CDCl3)

圖2 化合物1和2的1H-1H COSY和HMBC相關(guān) Fig.2 The 1H-1H COSY and HMBC correlations for compounds 1 and 2

1996年，Chu等[5]分離得到兩個新化合物Sch53823與Sch53825，化合物Sch53825的結(jié)構(gòu)主要通過與化合物Sch53823的波譜數(shù)據(jù)比對及采用化學(xué)衍生化的方式得到判斷。實驗成功將化合物Sch53825衍生化為乙酰化產(chǎn)物Sch53829，并對化合物Sch53829通過二維核磁共振數(shù)據(jù)(包括NOESY譜圖)分析的方式確定出化合物的平面結(jié)構(gòu)及相對構(gòu)型。因此，化合物Sch53825的構(gòu)型同樣得到確定。2000年，Bode等[6,7]采用13C、18O同位素標(biāo)記實驗對化合物cladospirone bisepoxide生物合成途徑中的關(guān)鍵中間體與終產(chǎn)物實現(xiàn)分離及結(jié)構(gòu)鑒定，闡明了化合物完整的生物合成途徑。根據(jù)該類化合物的生物合成途徑，可見化合物結(jié)構(gòu)中C-2、C-3位雙鍵氧化為三元氧環(huán)基團后，化合物H-2與H-3的空間朝向均為α[8]。因此，根據(jù)與類似物一致的生物合成途徑，化合物1結(jié)構(gòu)中H-2與H-3的空間朝向保持一致。通過分析H-1與H-2間的耦合常數(shù)(J= 2.4 Hz)，暗示H-1與H-2間為順式構(gòu)型，通過比對化合物1與確定構(gòu)型的類似物之間的波譜數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)與文獻中順式構(gòu)型的耦合常數(shù)相符[5,9-13]。根據(jù)以上數(shù)據(jù)推斷化合物1的構(gòu)型與化合物Sch53825一致。化合物1和2的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

化合物2淡黃油狀，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；HR-ESI-MS：m/z357.228 8[M+COOH]-(calcd for C19H33O6，357.227 3)，推測分子式為C18H32O4。化合物2的1H NMR中顯示，2個烯烴質(zhì)子信號δH：6.43(s，1H)和5.96(s，1H)；3個次甲基信號δH：5.09(m，1H)、4.51(d，1H)、4.24(m，1H)；9個亞甲基信號δH：1.99(m，2H)、1.95(m，2H)、1.71(m，2H)、1.44～1.32(m，6H)、1.32～1.19(m，6H)；2個甲基信號δH：1.57(br s，3H)、0.88(t，3H)。化合物2的13C NMR中，顯示18個碳信號見表2。再結(jié)合1H-1H COSY和HMBC相關(guān)數(shù)據(jù)，該化合物NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物Conocandin為相似結(jié)構(gòu)[14]，其化合物基本骨架一致(見圖2)，但是化合物2的C-3的C-4的化學(xué)位移值由δC：55.0、63.0分別變?yōu)棣腃：73.1、85.3。結(jié)合其質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測為Conocandin的C-3的C-4的環(huán)氧基變?yōu)猷彾冀Y(jié)構(gòu)，即鑒定該化合物為3，4-二羥基-10-甲基-2-亞甲基十六碳-9-烯酸。

表2 化合物2的1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)數(shù)據(jù)(CDCl3)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

化合物3白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；分子式為C19H18N2O2。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.08(2H，s，H-1，1′)，7.66(2H，dd，J= 8.0，8.0 Hz，H-5，5′)，7.39～7.32(2H，m，H-8，8′)，7.25～6.98(6H，m，H-2，2′，6，6′，7，7′)，4.76(1H，d，J= 7.2 Hz，H-10)，4.56(1H，td，J= 6.9，3.6 Hz，H-11)，3.71(2H，m，H-12)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：122.7(C-2)，119.4(C-3)，127.3(C-4)，116.8(C-5)，119.7(C-6)，122.3(C-7)，111.2(C-8)，136.4(C-9)，37.0(C-10)，74.8(C-11)，65.3(C-12)，122.4(C-2′)，119.3(C-3′)，126.9(C-4′)，115.4(C-5′)，119.52(C-6′)，122.2(C-7′)，111.2(C-8′)，136.3(C-9′)。以上 數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，故鑒定該化合物為3，3-二-(3-吲哚)丙烷-1，2-二醇。

化合物4白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；分子式為C16H17N3O2；HR-ESI-MS：m/z284.139 4[M+H]+(calcd for C16H18N3O2，284.139 4)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.15(1H，s，H-16)，7.59(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6)，7.40(1H，d，J= 8.2 Hz，H-3)，7.31(1H，s，H-9)，7.25～7.21(1H，m，H-4)，7.13(1H，d，J= 5.6 Hz，H-5)，5.72(1H，s，H-11)，4.38(1H，d，J= 10.8 Hz，H-14)，3.77(1H，dd，J= 15.1，3.0 Hz，H-10)，3.71～3.54(1H，m，H-10)，2.97(2H，dd，J= 15.1，10.8 Hz，H-17)，2.40～2.28(2H，m，H-18)，2.03～2.01(2H，m，H-19)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.7(C-2)，111.6(C-3)，122.9(C-4)，120.1(C-5)，118.5(C-6)，126.7(C-7)，110.0(C-8)，123.3(C-9)，26.9(C-10)，54.5(C-11)，165.1(C-12)，59.2(C-14)，169.4(C-15)，45.5(C-17)，22.6(C-18)，28.4(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻中的兩個同分異構(gòu)體brevianamide F與環(huán)(D-色-L-脯)二肽進行比較[16]，發(fā)現(xiàn)化合物4與環(huán)(D-色-L-脯)二肽的數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為環(huán)(D-色-L-脯)二肽。

化合物5白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；分子式為C11H12O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.38(1H，s，6-OH)，6.33(1H，s，H-5)，4.73～4.62(1H，m，H-3)，3.98(3H，s，H-11)，2.84(1H，d，J= 2.2 Hz，H-4)，2.83(1H，s，H-4)，1.51(3H，d，J= 6.3 Hz，H-2)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.1(C-1)，20.7(C-2)，75.9(C-3)，34.4(C-4)，105.3(C-5)，154.9(C-6)，133.0(C-7)，155.5(C-8)，102.2(C-9)，135.6(C-10)，60.9(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致，故鑒定該化合物為6-demethylkigelin。

化合物6白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；分子式為C11H12O6。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.60(1H，s，H-5)，4.45(2H，m，H-3，4)，3.83(3H，s，H-11)，1.44(3H，d，J= 5.8 Hz，H-2)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：170.5(C-1)，18.3(C-2)，81.4(C-3)，69.5(C-4)，106.7(C-5)，158.9(C-6)，135.8(C-7)，157.5(C-8)，100.9(C-9)，140.3(C-10)，60.9(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故鑒定該化合物為lignicol。

化合物7白色粉末狀固體，易溶于甲醇、二氯甲烷和氯仿等有機溶劑；分子式為C9H7NO。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：10.08(1H，s，H-1)，8.74(1H，s，H-10)，8.33(1H，t，J= 8.0，4.0 Hz，H-5),7.86(1H，d，J= 2.9 Hz，H-2)，7.49～7.40(1H，m，H-8)，7.34～7.32(2H，m，H-6，7)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.6(C-2),119.8(C-3)，124.5(C-4),124.4(C-5)，122.0(C-6)，123.1(C-7)，111.5(C-8)，135.2(C-9)，185.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物為indole-3-carboxaldehyde。

化合物8白色粉末狀固體，易溶于甲醇；分子式為C14H20N2O5。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.03(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2，6)，6.70(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，4.36(1H，s，H-8)，4.04(1H，dd，J= 10.6，6.3 Hz，H-2′)，3.55(1H，dd，J= 20.3，8.5 Hz，H-5′)，3.36(1H，dd，J= 12.4，6.1 Hz，H-5′)，3.09(1H，dd，J= 14.2，5.1 Hz，H-7)，3.02(1H，dd，J= 14.2，4.6 Hz，H-7)，2.13～2.05(1H，m，H-3′)，1.80(2H，s，H-4′)，1.28～1.13(1H，m，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：127.6(C-1)，132.1(C-2，6)，116.2(C-3，5)，157.7(C-4)，37.7(C-7)，57.9(C-8)，167.0(C-9)，170.8(C-1′)，60.1(C-2′)，29.4(C-3′)，22.7(C-4′)，45.9(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，故鑒定化合物為N-(5-amino-2-hydroxy-1-oxopentyl)-tyrosine。

2.2 單體化合物最低抑菌濃度的測定

對單體化合物對植物病原細菌的抗菌活性測試結(jié)果見表3，金霉素為陽性對照。化合物2對不同革蘭氏陰性細菌的活性不同，其中對青枯勞爾氏菌的抑菌活性較強，MIC值為7.81 μg/mL，對水稻黃單胞菌其次，MIC值為31.25 μg/mL，化合物3對青枯勞爾氏菌有明顯抗菌活性，MIC值為62.5 μg/mL。化合物1、5和6表現(xiàn)了微弱的抗菌活性，化合物4、7和8沒有表現(xiàn)出特別明顯的抗菌活性。化合物1與Sch53825結(jié)構(gòu)類似，據(jù)文獻報道螺二萘類化合物具有較好的生物活性[21-24]，但化合物1的抑菌活性弱于Sch53825。

表3 化合物的最低抑菌濃度

3 討論與結(jié)論

本研究在三株大興安嶺森林凋落物真菌SGSF622、SGSF289和SGSF062中分離獲得8個化合物，包括兩個新化合物，1-甲氧基-Sch53825(1)與3，4-二羥基-10-甲基-2-亞甲基十六碳-9-烯酸(2)，解析了它們的平面結(jié)構(gòu)，但它們的立體構(gòu)型還有待進一步研究，它們的旋光數(shù)據(jù)及其他波譜數(shù)據(jù)，也有待進一步補充。本文中化合物的立體結(jié)構(gòu)是通過對比文獻的核磁數(shù)據(jù)得出，其準(zhǔn)確絕對構(gòu)型還有待進一步研究。本研究的三株真菌隸屬的真菌屬，都曾被報道過天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其生物活性：Berkleasmium屬真菌曾被報道過具有抗真菌、抗細菌及抗腫瘤活性[21-24]，2009年Cai等[22]報道從內(nèi)生菌Berkleasmiumsp.Dzf12發(fā)酵液中分離diepoxinη和diepoxinζ的混合物以及diepoxinκ，它們與本文中化合物1具有類似結(jié)構(gòu)同屬于螺二萘類化合物，該文還報道了它們對大腸桿菌(Escherichiacoli)、根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、番茄瘡痂病菌(X.vesicatoria)、黃瓜角斑病菌(P.lachrymans)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等有較好的抑制活性。Oidiodendron真菌曾分離到10-methoxydihydrofuscin、fuscinarin和fuscin。這些化合物被發(fā)現(xiàn)可以有效地與巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-1R結(jié)合到人類CCR5上，CCR5是一個重要的抗HIV-1靶點，可以干擾HIV進入細胞[25]，本研究中未發(fā)現(xiàn)這些化合物。Qiu[3]在Parapyenchaeta屬真菌SGSF449分離其天然產(chǎn)物，從其發(fā)酵物中分離代謝產(chǎn)物4，6，8-三羥基-7-甲氧基-3-甲基二氫異香豆素，該化合物首次于柱頂孢霉屬(Scytalidium)中分離出來，命名為lignicol[18]，與本文化合物6的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。本研究首次報道化合物1與化合物2的波譜數(shù)據(jù)，以及化合物2和化合物3抑制細菌的活性。除化合物6外，其余化合物均為首次從三株真菌所屬的真菌屬中分離得到[3]。本研究豐富了大興安嶺森林凋落物真菌的天然產(chǎn)物的研究，為進一步開發(fā)利用大興安嶺森林真菌資源打下了基礎(chǔ)。