Streptomyces sp.KC17012次生代謝產物及抗菌活性研究

何江波，康大偉，陳 秀，王紀愛，王 濤，畢曉旭，欒 杰，曹艷茹*

1昆明學院醫學院，昆明 650214；2云南省疾病預防控制中心理化檢測中心，昆明 650022

鏈霉菌屬于革蘭氏陽性菌，原核生物界、放線菌目(Actinobacterales)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、鏈霉菌屬(Streptomyces)。鏈霉菌是一類重要的微生物資源，主要存在于土壤、海洋、淡水等生態系統中，被廣泛應用于藥物研究，農業殺蟲劑、除草劑等方面[1]。鏈霉菌具有神奇的創造功能，可以產生大量結構新穎且具有較好生物活性的次生代謝產物，且多數代謝產物為含氮類型的化合物。據統計，在目前發現的微生物活性產物中，由鏈霉菌產生的次生代謝產物約占總數的2/3[2]。醫學應用的抗生素多為鏈霉菌代謝產物，如氨基糖苷類抗生素等，這些抗生素在醫學及農業生產中發揮著舉足輕重的作用[3]。近年來，隨著普通環境微生物的研究日漸成熟，特殊環境微生物，例如海洋、火山口、極地等極端環境成為研究的熱點。Li等[4]從海洋鏈霉菌HS-34中分離得到具有抗副溶血性弧菌的化合物。Ye等[5]從廣西紅樹林土壤中分離得到兩株鏈霉菌，并發現兩株菌的次生代謝產物均對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用；Zhou等[6]從極地真菌GeomycespannorumSA3-2-YM的次級代謝產物中發現具有腫瘤細胞毒活性的環二肽化合物。鏈霉菌KC17012是我們課題組從東川銅礦土中分離得到，通過菌株形態與特征，結合16S rRNA基因的系統進化分析，確定該菌株為一株新菌株(GenBank number:MW526995)。因此，我們課題組繼續對Streptomycessp.KC 17012進行深入研究，旨在闡明其次生代謝產物，為該菌的深入開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

質譜儀(美國Agilent 6500系列Q-TOF LC/MS)；核磁共振儀(Avance 600 MHz，TMS 作為內標，δ為ppm，J為Hz)；制備液相(江蘇漢邦，Hanbon-NP 7000C)；制備柱(安捷倫Zorbax，XDB-C18，21.2 mm×150 mm，5 μm)；萬分之一電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，ZWY-2102)；柱層析用硅膠、薄層層析用硅膠GF254(青島海洋化工廠有限公司)；Sephadex LH-20(美國GE公司)；RP-18(日本YMC產品，40～60 μm)；D101大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；色譜試劑(上海星可高純度試劑公司)；石油醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑均為工業純度經重蒸后使用。顯色劑為H2SO4(10%)的乙醇液。

1.2 菌種與材料

菌株鑒定：自云南昆明東川銅礦中分離，16S rRNA基因序列分析結果表明KC 17012為鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株。大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)以及枯草芽孢桿菌(ATCC6051)，以上病原菌均購于上海藥物研究所。菌種目前保存于昆明學院農學與生命科學學院菌種庫(編號為KC 17012)。

菌株KC 17012活性培養基：PDA培養基(g/L)，土豆 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL，121 ℃，滅菌30 min 。

菌株KC 17012發酵培養基：PDB 培養基(g/L)，土豆200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL，121℃，滅菌 30 min。

指示菌培養基：LB 固體培養基(g/L)，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL。

1.3 菌株活化與種子液的培養

將保存于4 ℃的菌株KC 17012Streptomycessp.接種于PDA平板，28 ℃培養7天以進行活化。然后將單菌落接種至改良ISP 2培養基(1 L)：酵母膏4 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖4 g，動物蛋白胨2 g，植物蛋白胨1 g，微量鹽1 mL，復合維生素少許，自來水1 000 mL，pH 7.2，恒溫搖床28 ℃，180 r/min，發酵3天，作為種子液。

1.4 菌株發酵

將種子液接種至PDB培養基25 L(土豆200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL，121 ℃，滅菌30 min)，200 mL/瓶，培養8天，28 ℃，180 r/min，發酵液采用紗布過濾，收集濾液，得發酵液25 L，然后將發酵液濃縮至2 L。

1.5 提取與分離

采用等體積的乙酸乙酯對發酵液進行萃取，共3次，濃縮萃取液，得乙酸乙酯浸膏43 g。將乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，過濾，除去不溶物，然后采用D101大孔樹脂柱(直徑80 mm×長度500 mm)初步分離，洗脫劑為10%→100%乙醇水梯度洗脫；根據薄層色譜(TLC)，10%硫酸乙醇溶液顯色合并相似成分，得6個組分Fr A～F。Fr A組分(1.3 g)，經Sephadex LH-20柱(MeOH)純化，得到Fr A 1～3，Fr A-1組分(230 mg)經過多次硅膠柱層析除去雜質，然后結晶得到化合物2(120 mg),再次從母液中分離得到化合物3(72 mg)。Fr A-2 部分(137 mg)，采用多次硅膠柱色譜分離后得到化合物1(16 mg)。FrA-3 部分(70 mg)經過反復結晶得到純品化合物4(55 mg)。Fr B組分(2.1 g)，采用Sephadex LH-20柱(MeOH)純化，得Fr B1～4。組分Fr B1經RP-18反相柱色譜分離得Fr B1-1(80 mg)，采用制備液相分離純化，以10%-100%色譜甲醇梯度洗脫(流速10 mL/min)得化合物5(19 mg，tR=11.43 min)和化合物6(21 mg，tR=13.23 min)。組分Fr B2(248 mg)采用硅膠柱(二氯甲烷∶甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，得到化合物7(18 mg)。Fr B3(120 mg)，采用硅膠柱(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，得到化合物8(22 mg)。組分Fr B4(330 mg)通過多次結晶，得到純度較高的化合物9(12 mg)。Fr C組分(3.1 g)，經Sephadex LH-20柱(MeOH)分離得到Fr C 1～3，Fr C-1組分(90 mg)采用硅膠柱色譜(二氯甲烷：甲醇20∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，得到化合物10(11 mg)。Fr C-2 部分(430 mg)，采用硅膠柱色譜分離后得到組分Fr C-2-1(107 mg)，然后采用制備液相，以40%-80%色譜甲醇梯度洗脫(流速10 mL/min)得化合物11(3 mg)和化合物12(43 mg)。Fr C-3 部分(200 mg)采用硅膠柱色譜分離到純品化合物13(57 mg)。Fr D組分(1.1 g)，采用Sephadex LH-20柱(MeOH)分離得Fr D1～3。組分Fr D1(100 mg)經RP-18反相柱色譜分離，得到樣品Fr D1-1(37 mg)，采用硅膠柱色譜(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫得化合物14(1.8 mg)和化合物15(27 mg)。Fr D2(35 mg)采用硅膠柱(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，得到化合物16(3.8 mg)。組分Fr D3(49 mg)采用制備液相，得化合物17(7 mg)。組分Fr F(1.01 g)通過多次結晶，得到純度較高的化合物18(200 mg)。

1.6 體外抗菌活性檢測

本研究采用微量稀釋法檢測化合物的體外抑菌活性。分別將大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)以及枯草芽孢桿菌(ATCC6051)接種于LB固體培養基，37 ℃培養24 h后，挑取單菌落2～3個于20 mL LB液體培養基中，37 ℃，180 r/min，搖床培養6 h，用LB液體培養基稀釋成1×105CFU/mL菌懸液。稱取適量的化合物1～18，用DMSO配制成100 μmol/L的儲存液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾。取無菌的96孔板，外周36孔分別加入100 μL無菌水，其余每孔加入100 μL 1×105CFU/mL菌懸液。同時，選取環丙沙星作為陽性對照，DMSO作空白對照，且每個梯度設3個復孔，微板觀察法檢測其最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。

2 實驗結果

本文對Streptomycessp.KC 17012的次生代謝產物進行研究，分離鑒定了18個化合物(見圖1)，其中包括二肽類，吲哚衍生物類，脫落酸類似物等，我們對分離得到的化合物進行體外抑菌活性測試，結果表明化合物1和10具有較好地抑制枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的活性。

圖1 化合物1～18的結構式Fig.1 The chemical structures of compounds 1-18

2.1 結構鑒定

化合物5無色油狀物；分子式C11H12N2O2，ESI-MS：m/z205 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.87(1H，br s，COOH)，7.55(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4)，7.33(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，7.18(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，7.05(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，6.97(1H，t，J= 7.8 Hz，H-5)，3.41(1H，dd，J= 9.0，4.2 Hz，H-2′)，3.30(1H，dd，J= 15.0，4.2 Hz，H-1a′)，2.94(1H，dd，J= 15.0，9.0 Hz，H-1b′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：123.9(C-2)，109.8(C-3)，118.4(C-4)，120.9(C-6)，111.3(C-7)，136.3(C-8)，127.3(C-9)，27.3(C-1′)，54.8(C-2′)，170.3(C-3′)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物5為色氨酸。

化合物7無色油狀物，易溶于甲醇；分子式C9H7NO2，ESI-MS：m/z162 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.96(1H，dd，J= 7.2，1.2 Hz，H-5)，7.85(1H，s，H-2)，7.33(1H，dd，J=7.2，1.2 Hz，H-8)，7.08(2H，m，H-67)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：133.5(C-2)，127.7(C-3)，108.9(C-4)，123.7(C-5)，122.2(C-6)，122.5(C-7)，113.0(C-8)，138.4(C-9)，169.4(C-10)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物7為3-羧基吲哚。

化合物8無色油狀物；分子式C7H7NO2，ESI-MS：m/z138 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.83(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-5)，7.25(1H，td，J= 7.2，1.8 Hz，H-3)，6.72(1H，dd，J= 7.8，0.6 Hz，H-2)，6.58(1H，t，J= 7.2，1.2 Hz，H-4)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物8為鄰氨基苯甲酸。

化合物15無色油狀物；分子式C13H20O3，ESI-MS：m/z247 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.78(1H，br s，H-4)，5.70(1H，dd，J= 16.4，4.8 Hz，H-8)，5.67(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，4.22(1H，m，H-9)，2.38(1H，d，J= 16.8 Hz，H-2a)，2.06(1H，d，J= 16.8 Hz，H-2b)，1.81(3H，d，J= 4.8，1.2 Hz，H-13)，1.14(3H，d，J= 6.4 Hz，H-10)，0.94(3H，s，H-12)，0.92(3H，s，H-11)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：42.6(C-1)，50.8(C-2)，201.4(C-3)，127.3(C-4)，167.6(C-5)，80.0(C-6)，137.1(C-7)，130.1(C-8)，68.8(C-9)，24.6(C-10)，23.5(C-11)，24.0(C-12)，19.7(C-13)。以上數據與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物15為布盧門醇 A。

化合物16無色油狀物，易溶于甲醇；分子式C13H20O3，ESI-MS：m/z225 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.02(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，6.29(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8)，3.91(1H，m，H-3)，2.39(1H，dd，J= 14.5，5.0 Hz，H-4β)，2.28(3H，s，H-10)，1.67(1H，m，H-4α)，1.64(1H，m，H-2α)，1.26(1H，m，H-2β)，1.20(6H，s，H-12，13)，0.98(3H，s，H-11)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，46.7(C-2)，64.3(C-3)，40.5(C-4)，67.2(C-5)，69.8(C-6)，142.4(C-7)，132.8(C-8)，197.3(C-9)，28.2(C-10)，25.5(C-11)，29.1(C-12)，19.7(C-13)。以上數據與文獻[20]報道一致，故鑒定化合物16為3α-hydroxy-5α，6α-epoxy-7-megastigmen-9-one。

化合物17白色粉末；分子式C20H22O7，ESI-MS：m/z377 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.99(1H，d，J= 1.2 Hz，H-2′)，6.86(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-6′)，6.78(1H，dd，J= 7.8 Hz，H-5′)，6.62(1H，s，H-2)，6.59(1H，s，H-6)，5.51(1H，d，J= 6.0 Hz，H-7′)，3.84(1H，m，H-9a′)，3.84(4′-OCH3)，3.77(1H，dd，J= 11.4，7.8 Hz，H-9b′)，3.67(9-OCH3)，3.47(1H，m，H-8′)，2.82(2H，t，J= 7.8 Hz，H-7)，2.61(2H，t，J= 7.8 Hz，H-8)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：135.4(C-1)，116.6(C-2)，130.1(C-3)，147.1(C-4)，142.3(C-5)，117.1(C-6)，31.8(C-7)，37.3(C-8)，175.5(C-9)，135.1(C-1′)，110.6(C-2′)，147.6(C-3′)，149.2(C-4′)，116.2(C-5′)，119.8(C-6′)，88.9(C-7′)，55.9(C-8′)，65.2(C-9′)，56.5(4′-OCH3)，52.2(9-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道一致，故鑒定化合物17為trogopterin A。

化合物18白色粉末；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.28(1H，d，J= 4.2 Hz，H-6)，3.45(1H，m，H-3)，1.18(3H，s，H-19)，0.86(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.76(6H，overlap，H-26，27)，0.61(3H，s，H-18)。采用TLC展開，10%硫酸乙醇顯色為紫色化合物，并與標準品對照，確定該化合物18為β-谷甾醇；

2.2 體外抗菌活性檢測結果

本實驗采用的受試菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)。采用微板觀察法檢測其MIC值，其中用環丙沙星作為陽性對照，化合物1和10有較好的抑菌活性，其MIC值分別為11和33 μmol/L(陽性對照環丙沙星MIC為2 μmol/L)。

3 討論與結論

鏈霉菌具有神奇的創造功能，其次生代謝產物多具有顯著的生理活性[3]。本文對東川銅礦來源鏈霉菌KC17012發酵液進行分離，得到18個成分，主要為二肽類、吲哚生物堿衍生物、脫落酸類似物等。其中化合物1和10通過體外抗菌活性檢測，其體外抑菌活性MIC為11 和33 μmol/L，其余化合物均沒有活性。化合物1～4為二肽類成分，含量較大，而化合物3是由D-型脯氨酸和L-型酪氨酸構成，這種由D-型氨基酸參與的肽類物質的構成形式在自然界中存在較少。化合物11～14為脫落酸(ABA)類似物成分。ABA是一種重要的植物激素，在調節植物生長，抵抗極端外環境等方面具有重要作用。但是ABA生產成本較高，難以大規模工業化生產，因此利用微生物代謝產生ABA具有廣闊的應用空間。本文研究鏈霉菌KC17012發酵液的次級代謝產物及單體成分的抗菌活性，為后期深入挖掘該化合物的其他抗菌活性及抗菌機制提供了科學參考。