復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠PI3K/Akt信號通路及足細胞凋亡的影響

賈世艷 仲啟明 司瑞花 范曉陽 嚴文允 劉光珍

膜性腎病是成人腎病綜合征的主要病因，約40%的患者在10年內進展為終末期腎病，依賴腎透析治療[1-3]。目前膜性腎病治療以激素、免疫抑制劑和細胞毒類藥物為主，長期療效和安全性有待臨床的全面評估[4]。因此，尋找更安全有效的膜性腎病治療藥物成為亟待解決的問題。足細胞自我修復和再生能力有限，其損傷程度與膜性腎病預后密切相關，細胞凋亡是導致足細胞數量減少的重要機制和促進膜性腎病發展的重要因素，因此干預足細胞凋亡是延緩和治療膜性腎病有效策略[5-7]。復方蛇龍膠囊是課題組根據多年治療慢性腎臟病臨床經驗，總結出“清熱利濕，活血化瘀”中醫組方理論基礎上形成的，前期研究表明復方蛇龍膠囊具有較高臨床緩解率，且無明顯毒副作用[8-9]。本研究擬從蛋白尿緩解、腎組織病理學改變和足細胞凋亡等方面，觀察復方蛇龍膠囊對陽離子化牛血清白蛋白誘導膜性腎病大鼠的治療作用，進一步探討其治療膜性腎病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質量160～180 g，6周齡，共60只，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2017-0005，實驗方案符合山西省中醫藥研究院動物倫理要求，飼養環境為溫度23～26 ℃，濕度45～50%，自由飲食飲水。

1.2 實驗藥物

復方蛇龍膠囊由穿山龍(批號：20191101)、鬼箭羽(批號：20190901)和白花蛇舌草(批號：20190801)組成，三種飲片均購自山西省中醫院藥房。將上述3味中藥加10倍水煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，備用；雷公藤多苷片(湖南千金協力藥業有限公司，規格：10 mg。批號：20170602)。

1.3 主要試劑與儀器

陽離子化牛血清白蛋白，弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司，批號分別為102062773、344291)；肌酐(serum Creatinine，SCr)，甘油三脂(triglycerides，TG)，總膽固醇(total cholesterol，TC)，白蛋白(albumin，ALB)，總蛋白(total protein，TP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20210225、20210304、20210226、20210226、20210301)；微量白蛋白(microalbumin，mALB)酶聯免疫吸附試劑盒(江蘇蘇州酶免生物技術有限公司，批號202012)；QuantiNova SYBR Green PCR Kit(德國QIAGEN公司，批號208054)；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號2268313)；兔來源一抗Nephrin，Podocin，Bcl-2，Bad，磷酸化蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-Akt)，β-Actin(Abcam公司，批號分別為ab216341、ab181143、ab196495、ab32445、ab38449、ab179467)；二抗(Abcam公司，批號ab97051)。

H1型多功能微孔板讀板機(美國博騰)；7500型實時熒光定量儀(美國ABI公司)；Veriti9902型定性PCR儀(美國ABI公司)；Beckman Coulter流式細胞儀(美國Beckman公司)；Mini-Protean型電泳系統，Mini Trans-Blot轉印系統(美國伯樂公司)；Kodak Image Station 2000MM成像系統(美國Kodak公司)；正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)；超薄切片機(Leica公司)；透射電子顯微鏡(Hitachi公司)。

1.4 動物模型制備、實驗分組及給藥

大鼠適應性喂養一周后，60只SD大鼠隨機分為正常組10只，造模組50只。按照改良 Border 法制備膜性腎病大鼠模型[10]，以大鼠24小時尿蛋白≥20 mg作為模型制備成功的標準。造模成功后，隨機分為模型組、雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組，每組10只。大鼠給藥劑量根據人與大鼠的體表面積換算成等效給藥劑量[11]，分別給予雷公藤多苷片7.5 mg/kg，復方蛇龍膠囊0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續8周。使用代謝籠留取大鼠24小時尿液，離心取上清，4℃保存備用；實驗結束后，大鼠禁食水12小時后使用異氟烷吸入麻醉，留取血清及腎組織，-80℃保存備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 血液和尿液生化指標檢測 按照試劑盒說明使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清SCr、TG、TC、ALB、TP含量，采用酶聯免疫吸附法檢測尿mALB含量。

1.5.2 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)、馬松(Masson)染色和透射電鏡檢測腎臟組織病理學變化 將固定于4%多聚甲醛的腎組織脫水，石蠟包埋，切片，分別按照HE和Masson染色方法進行制片，光學顯微鏡下觀察腎臟組織形態學變化；2.5%戊二醛溶液固定腎組織，放置于PBS中浸洗3次，1%鋨酸固定，丙酮逐級脫水后進行包埋聚合、超薄切片，乙酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色，進行透射電鏡觀察并拍照。

1.5.3 流式細胞術檢測腎臟組織細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組腎臟組織細胞凋亡變化，按照凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀上機檢測。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測腎組織Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad mRNA表達 采用Trizol法提取腎組織總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制擴增體系，擴增條件為95 ℃ 5分鐘，95 ℃ 5秒，60 ℃ 35秒，循環40次。以GAPDH為內參，使用2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達水平。引物委托上海生物工程技術有限公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.5.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腎組織蛋白表達 使用RIPA緩沖液提取腎組織總蛋白，與5×Loading buffer混勻后100 ℃變性5分鐘，10% SDS-PAGE凝膠電泳45分鐘，PVDF轉膜90分鐘，5% BSA封閉PVDF膜60分鐘，一抗(Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad、β-Actin，1∶2 000)室溫孵育120分鐘，洗膜后二抗(1∶5 000)室溫孵育30分鐘，ECL法顯色，用Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶/β-Actin 條帶灰度值作為蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠mALB、ALB、TP、TC、TG、SCr含量的影響

與正常組比較，模型組ALB和TP明顯降低，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組血清ALB和TP明顯升高，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 復方蛇龍膠囊對大鼠血液和尿液生化指標的影響

2.2 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織病理學改變的影響

正常組腎小球結構完整，腎小管上皮細胞形態結構正常，未見腎組織纖維化，腎小球基底膜結構完整，細胞器結構形態正常；模型組腎小球結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，藍色膠原纖維組織出現，基底膜增厚，足細胞損傷；與模型組相比，雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎小球和足細胞形態結構不同程度改善，腎組織纖維化面積減少，腎小球基底膜病變減輕。見圖1～3。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復方蛇龍膠囊低劑量組；E 復方蛇龍膠囊中劑量組；F 復方蛇龍膠囊高劑量組。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復方蛇龍膠囊低劑量組；E 復方蛇龍膠囊中劑量組；F 復方蛇龍膠囊高劑量組。

2.3 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡的影響

與正常組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖4。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復方蛇龍膠囊低劑量組；E 復方蛇龍膠囊中劑量組；F 復方蛇龍膠囊高劑量組。與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin表達的影響

與正常組比較，模型組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表3，4，圖5。

表3 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達的影響

表4 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達的影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復方蛇龍膠囊低劑量組；E 復方蛇龍膠囊中劑量組；F 復方蛇龍膠囊高劑量組。

2.5 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎組織p-Akt、Bcl-2、Bad表達的影響

與正常組比較，模型組p-Akt蛋白表達明顯降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯降低，Bad mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組p-Akt蛋白表達明顯升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表達明顯升高，Bad mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表5、6，圖6。

表5 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎Bcl-2、Bad mRNA表達影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復方蛇龍膠囊低劑量組；E 復方蛇龍膠囊中劑量組；F 復方蛇龍膠囊高劑量組。

表6 復方蛇龍膠囊對膜性腎病大鼠腎p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白表達影響

3 討論

膜性腎病臨床進展緩慢，病程較長，因此，對于經保守治療未達到自發緩解的顯著蛋白尿患者，KDIGO指南推薦包括皮質類固醇和環磷酰胺交替療程的改良Ponticelli方案作為一線治療[12-13]。近年來，我國傳統醫藥在膜性腎病治療的臨床實踐中積累了大量臨床研究成果，在世界范圍內逐漸得到認可和廣泛應用[14-15]。

膜性腎病的主要臨床表現為蛋白尿和低蛋白血癥，是膜性腎病診斷和療效評價的關鍵指標[16]。腎小球濾過屏障功能和形態異常，導致尿蛋白含量升高，血清ALB和TP含量下降，進而促使肝臟代償性合成白蛋白和脂蛋白等，誘發高脂血癥，加重腎小球硬化、腎管間質損傷等，相互作用促進病程進展，致使腎小球硬化，最終進展為終末期腎病[17-18]。本研究采用改良Border法制備膜性大鼠模型，研究結果顯示復方蛇龍膠囊干預8周后，大鼠尿mALB含量明顯降低，血清ALB明顯升高，血尿生化指標趨于正常，腎臟病理損傷程度得到改善，進一步說明復方蛇龍膠囊能通過改善腎小球濾過屏障功能、減輕足細胞損傷、減少腎組織纖維化程度，從而延緩膜性腎病進展。

腎小球濾過屏障由腎小球內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成。足細胞是一種高度分化的上皮細胞，通過調節穿過分隔血液和尿間隙的毛細血管壁的選擇性過濾而構成腎濾過屏障的核心細胞基礎[19]。作為膜性腎病發病的關鍵機制，足細胞損傷主要與足細胞特異性蛋白及細胞骨架蛋白表達異常相關，Podocin是足細胞中唯一整合膜蛋白，能夠直接與Nephrin相互作用，在形成足細胞裂孔膜支架和控制腎小球濾過膜通透性中具有重要作用，Podocin表達水平降低將導致足細胞凋亡和裂孔膜結構被破壞[20-21]。Nephrin作為裂孔膜的關鍵成分，能夠向細胞內傳遞信號，Nephrin表達缺失或細胞內信號傳導異常將導致足細胞形態改變和蛋白尿產生[22-23]。本研究結果顯示，復方蛇龍膠囊干預后能夠抑制膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡，促進足細胞標志分子Nephrin和Podocin表達水平升高，進而恢復足細胞結構和功能的完整性，修復腎小球濾過屏障功能，有效降低尿蛋白。

膜性腎病病程遷延，涉及多個基因和信號通路的改變，其復雜發病機制尚不完全清楚。研究表明激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路能夠抑制細胞凋亡，保護足細胞并改善蛋白尿[24-25]。p-Akt是PI3K的主要下游效應分子，能夠阻斷Bcl-2和Bad的結合，從而抑制細胞凋亡[26-27]。Bcl-2和Bad均為Bcl-2 家族成員，在維持線粒體膜完整性和細胞凋亡過程中發揮重要調控作用[28-30]。本研究顯示，膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡率明顯升高，Bad表達水平明顯升高，Bcl-2和p-Akt表達水平明顯降低，而經過復方蛇龍膠囊干預后，凋亡信號通路被抑制，Bad表達水平明顯降低，Bcl-2和p-Akt表達水平明顯升高，復方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎組織細胞凋亡率較模型組明顯降低，結果表明復方蛇龍膠囊對陽離子化牛血清白蛋白誘導的膜性腎病大鼠腎組織細胞凋亡具有較強的抑制作用。

綜上所述，復方蛇龍膠囊能夠抑制足細胞損傷和凋亡，維持細胞形態功能和數量穩定，進而恢復腎小球濾過屏障的完整性，減少尿蛋白含量，這一過程可能是通過PI3K/Akt信號通過實現，其詳細作用機制仍值得進一步探究。