基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大定風(fēng)珠治療帕金森病的作用機制

何亦婷，蔡燦佳，曾東禹，葉怡敏，李 平，林海玲，高分飛

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 汕頭 515041)

帕金森病是一種常見的慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要癥狀為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等[1]。帕金森病的發(fā)病機制可能與α-突觸核蛋白聚集、線粒體功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元凋亡等有關(guān)[2]。過去20年，全世界的帕金森病患病率和發(fā)病率均迅速上升，隨著人口老齡化的加劇，中國也處于帕金森病患病率急劇上升的階段[3]。目前治療帕金森病最有效的藥物是復(fù)方左旋多巴，但只能用來改善癥狀，不能延緩疾病的發(fā)展。長期服用左旋多巴治療，療效逐漸變差，同時也出現(xiàn)運動障礙等不良反應(yīng)[4]。帕金森病屬于中醫(yī)“顫證”范疇，《素問至真要大論》指出帕金森病的主要病變部位在“肝”，其基本病機為肝風(fēng)內(nèi)動[5]。臨床研究[6]還表明，75%的帕金森病患者中醫(yī)證型屬于肝腎陰虛，因此治療該病應(yīng)以“滋養(yǎng)肝腎、熄風(fēng)止顫”為根本原則[7]。

大定風(fēng)珠源于清代吳鞠通《溫病條辨下焦篇》，由生牡蠣、生龜板、鱉甲、阿膠、生白芍、生地黃、麥冬、五味子、火麻仁、生雞子黃、炙甘草11味藥組成，具有養(yǎng)陰潛陽、柔肝祛風(fēng)的功效[8]，現(xiàn)代多使用于眩暈、顫癥等病屬于真陰虧耗者[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大定風(fēng)珠可降低帕金森氏病蛋白7水平，提高神經(jīng)生長因子-3水平，以對抗帕金森病患者過度氧化應(yīng)激水平，避免神經(jīng)細胞炎癥損傷[10]。臨床上也報道[9，11]大定風(fēng)珠可用于治療帕金森病，但缺乏系統(tǒng)的研究。中藥成分的復(fù)雜性和功能作用的整體性提示，大定風(fēng)珠可能通過多成分、多靶點、整體進行調(diào)節(jié)從而發(fā)揮重要作用[12]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了大定風(fēng)珠治療帕金森病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 大定風(fēng)珠靶點查找與篩選

在Herb數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）查找大定風(fēng)珠各組分的活性成分及作用靶點，并以Lipinski五規(guī)則[13]（分子量＜500；氫鍵給體數(shù)目＜5；氫鍵受體數(shù)目＜10；脂水分配系數(shù)＜5；可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量＜10個）為標識篩選有效活性成分。通過Swiss Target Prediction數(shù) 據(jù) 庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）和Targetnet數(shù)據(jù)庫（http://targetnet.scbdd.com/）得到具有生物活性成分的靶蛋白。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）查詢其蛋白所對應(yīng)的人的基因，去除重復(fù)項后建立最終的中藥作用靶點。

1.2 帕金森病相關(guān)靶點獲取

運 用OMIM數(shù) 據(jù) 庫（https://omim.org/）、Genecards數(shù) 據(jù) 庫（https://www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）進行帕金森病相關(guān)靶點的檢索和篩選，去除重復(fù)項，匯總后建立最終疾病的靶點。

1.3 中藥靶點和疾病靶點的交集

將生成的靶點導(dǎo)入到Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）網(wǎng)站，匯總交集有效成分靶點和帕金森病靶點，得出帕金森病相關(guān)靶點和大定風(fēng)珠作用靶點的交集，即中藥—疾病靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 中藥—有效成分—靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點”互作網(wǎng)絡(luò)。中藥名稱、藥物活性成分和作用靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示。

1.5 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將從中藥—疾病韋恩圖中獲得的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），將物種定義為“人”，繪制大定風(fēng)珠治療作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 大定風(fēng)珠治療帕金森病關(guān)鍵靶點的獲得

將得到的大定風(fēng)珠治療作用靶點蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，進行蛋白評分。以參數(shù)自由度＞平均值為標準進行篩選[14]，若評分高于平均值且有相應(yīng)研究的支持，則規(guī)定該基因為大定風(fēng)珠治療帕金森病的關(guān)鍵靶點。

1.7 GO與KEGG通路富集分析

使用R語言和Cytoscape 3.8.2軟件將大定風(fēng)珠對帕金森病具有治療作用的靶點基因進行GO和KEGG通路分析。構(gòu)建GO圖和KEGG圖，分析作用靶點基因GO功能和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 大定風(fēng)珠作用靶點和帕金森病相關(guān)靶點獲取

通過Herb數(shù)據(jù)庫查詢大定風(fēng)珠的化學(xué)成分，經(jīng)過篩選之后，其所含化學(xué)成分數(shù)量如下：白芍7個、生地黃17個、麥冬32個、龜板6個、牡蠣1個、鱉甲1個、阿膠3個、甘草167個、五味子71個、芝麻12個、雞子黃2個。與此對應(yīng)的中藥作用靶點1 120個。通過系統(tǒng)疾病靶點數(shù)據(jù)庫（OMIM、Genecards、TTD），獲得疾病靶點863個。

2.2 大定風(fēng)珠—帕金森病互作靶點的篩取

大定風(fēng)珠靶點和帕金森病靶點，取交集后得到大定風(fēng)珠—帕金森病靶點共135個，見圖1。

圖1 大定風(fēng)珠—帕金森病靶點韋恩圖

2.3 中藥—有效成分—靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2和圖3。從圖中可看出同一靶點可對應(yīng)不同的活性成分，也可對應(yīng)相同的活性成分，這充分反映了大定風(fēng)珠多組分、多靶點的作用特點。

圖2 “中藥（除甘草外）—有效成分—靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖3 “甘草—有效成分—靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將135個共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建大定風(fēng)珠治療帕金森病潛在靶點的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，相互作用關(guān)系見圖4。

圖4 大定風(fēng)珠與帕金森病交集靶點的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 大定風(fēng)珠治療帕金森病關(guān)鍵靶點的獲得

將獲得的大定風(fēng)珠治療靶蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行分析，并使用網(wǎng)絡(luò)分析插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，得到潛在靶點基因拓撲參數(shù)自由度、介度中心度和接近中心度，自由度表示節(jié)點所包含的邊的數(shù)目，靶點自由度越大，表明通過該靶點發(fā)揮作用的可能性越大。結(jié)果，自由度＞8.5（平均值）的靶點有37個，其中與帕金森病相關(guān)的關(guān)鍵靶點有26個，見表1。

表1 大定風(fēng)珠治療帕金森病的26個關(guān)鍵靶點

2.6 GO功能富集分析結(jié)果

對大定風(fēng)珠和帕金森病的共同靶點進行GO功能富集分析，根據(jù)P＜0.05確定了2 797個GO條目，其中涉及生物過程（biological process，BP）的條目2 481個，主要涉及化學(xué)應(yīng)激、神經(jīng)元死亡等方面；涉及細胞組成（cellular component，CC）的條目148個，主要涉及膜閥、膜微結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)囊腔等方面；涉及分子功能（molecular function，MF）的條目168個，主要涉及細胞因子受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、淀粉樣β蛋白等方面，推測大定風(fēng)珠可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來起到治療帕金森病的作用，見表2和圖5。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖（P值排名前10）

表2 GO功能富集分析（P值排名前10）

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果

以P＜0.05進行篩選，得到293條信號通路，參與的主要通路包括cAMP信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸通路、細胞凋亡通路、Th17細胞分化通路、長壽調(diào)節(jié)通路、刺激神經(jīng)組織的中的交互通路、含血清素的神經(jīng)突觸通路、酪氨酸代謝通路。表明大定風(fēng)珠的有效成分可能通過作用以上通路來治療帕金森病，見表3和圖6。

表3 KEGG通路富集分析（P值排名前20）

3 討論

利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)生物信息分析方法，篩選中藥大定風(fēng)珠治療帕金森病的可能靶點和機制。通過對數(shù)據(jù)庫的初步篩選，獲得了319個可能的活性化學(xué)成分，預(yù)測了26個關(guān)鍵靶標。在蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中，治療靶蛋白之間錯綜復(fù)雜的相互作用顯示了大定風(fēng)珠作用的多樣性和復(fù)雜性。

研究表明，MAPK1的異常表達與神經(jīng)元死亡有關(guān)[15]，這在帕金森病發(fā)病和進展中起著重要作用。此外，關(guān)鍵目標STAT3可調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞增生[16]，APP可通過帕金森病腦區(qū)神經(jīng)元淀粉樣前體蛋白異常積累導(dǎo)致線粒體功能障礙[17]，EGFR可能在多巴胺能神經(jīng)元細胞死亡中發(fā)揮重要作用[18]，F(xiàn)YN可通過以下途徑參與帕金森病的發(fā)病機制，如調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡、神經(jīng)炎癥和谷氨酸興奮性毒性[2]。這表明本研究預(yù)測大定風(fēng)珠治療帕金森病的可行性。

GO分析的結(jié)果提示BP主要涉及化學(xué)應(yīng)激、神經(jīng)元死亡、突觸傳遞、氧化應(yīng)激等方面；CC主要涉及膜閥、膜微結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)囊腔、突觸前膜、神經(jīng)元胞體等方面；MF主要涉及細胞因子受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、淀粉樣β蛋白、離子通道、兒茶酚胺、蛋白酪氨酸激酶活性等方面，這與關(guān)鍵靶點分析相吻合。

通過KEGG富集結(jié)果以及查詢文獻可知，大定風(fēng)珠治療帕金森病主要通過cAMP信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸通路、Th17細胞分化通路等通路，對帕金森病的細胞多途徑干預(yù)。在cAMP信號通路中，cAMP是中樞神經(jīng)細胞的第二信使，對神經(jīng)元的存活、發(fā)育、認知，以及樹突、軸突的生長調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用；對星形膠質(zhì)細胞等多種細胞功能有著調(diào)節(jié)作用。這對大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有重要的意義[19]。大定風(fēng)珠的有效成分對神經(jīng)元的作用可能是通過對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、黑質(zhì)的神經(jīng)元進行發(fā)育和生存干預(yù)來實現(xiàn)的。多巴胺能神經(jīng)突觸通路涉及多巴胺在突觸前軸突終末釋放后作用等多種機制。多巴胺作為神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控運動、認知、獎賞機制、神經(jīng)內(nèi)分泌等多種功能。多巴胺與多種亞型受體結(jié)合，包含D1R（D1和D5受體）、D2R（D2、D3和D4受體），其調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、cAMP和細胞內(nèi)鈣離子的水平，對神經(jīng)元的活動產(chǎn)生重要的影響[20]。而多巴胺的傳遞功能障礙與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)[21]。大定風(fēng)珠的有效成分對神經(jīng)元的作用可能通過促進多巴胺的生成和釋放進行調(diào)控而發(fā)揮治療作用。對Th17細胞分化通路而言，Th細胞的平衡分化對人體免疫等至關(guān)重要，有研究表明，Th17細胞介導(dǎo)的IL-17信號通路可誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡。由Th17細胞分泌的IL-17與其受體結(jié)合，作用于多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的激活，進而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[22]。

綜上，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對大定風(fēng)珠的有效化合物、作用靶點、通路等進行綜合分析，初步驗證大定風(fēng)珠的可能機制。通過對MAPK1、APP、EGFR、FYN等關(guān)鍵靶點和多條通路的預(yù)測分析，為臨床藥物的研發(fā)提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。