microRNA-103通過調節自噬參與調控妊娠期糖尿病機制的臨床研究

郭美妹

妊娠期糖尿病是一種妊娠期獨有的疾病，也是產科的一種常見并發癥，指孕婦首次出現不同程度的糖代謝異常或葡萄糖不耐受[1]。該病具有較高的發病率，近幾年隨著孕婦年齡、生活方式、飲食習慣等的變化，導致其發病率出現了逐漸升高的發展趨勢[2]。妊娠期糖尿病的危害性大，會導致孕婦出現代謝功能紊亂，引發子癇前期、產后出血、產褥感染等并發癥，也會影響胎兒發育及新生兒的健康生長，可出現過期產兒、胎兒宮內窘迫、巨大兒、新生兒窒息、新生兒低血糖等不良后果[3-5]。而該病的發病機制尚不明確，可能和糖代謝異常、胰島素功能障礙、遺傳、炎癥反應、環境等因素有關，且通常是多種因素共同作用的結果[6-7]。近期有研究發現，妊娠期糖尿病患者有諸多具有重要功能的基因表達出現異常變化，但其核酸序列并未出現變化，而是通過表現遺傳學機制參與了疾病的發生與發展[8]。microRNA 是當前分子生物學與生物信息學的熱門領域，因其具有廣泛參與生物學過程的特征，使其在內分泌代謝領域中獲得了長足的進展[9]。有報道指出，microRNA 在妊娠期糖尿病的病理生理變化過程中起到了非常重要的作用，但其作用機制尚未闡明[10]。自噬是一種對細胞成分降解再利用的過程，在細胞生存中發揮著非常重要的作用[11]。正常狀況下，自噬可對細胞應激產生保護作用，但自噬過度會導致細胞損傷[12]。microRNA-103參與調節自噬的研究在近期引起了廣泛關注，其是否通過調節自噬參與了調控妊娠期糖尿病機制的研究尚未見報道。為此，本研究為了進一步探討microRNA-103 通過調節自噬參與調控妊娠期糖尿病的作用機制，對比分析了妊娠期糖尿病患者與正常孕婦胎盤組織的microRNA-103 表達水平及自噬情況，旨在為妊娠期糖尿病尋找新的基因靶向治療方法提供線索，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年8 月-2021 年8 月于莆田學院附屬醫院產科住院分娩的30 例妊娠期糖尿病孕婦納入研究組，另選取同時期住院分娩的30 例健康孕婦納入對照組。納入標準：（1）年齡20～42 歲；（2）經實驗室檢查、影像學檢查等證實為宮內妊娠；（3）研究組孕婦經葡萄糖耐量試驗證實為糖代謝異常，滿足文獻[13]《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》中的相關妊娠期糖尿病的診斷標準；（4）定期產檢并在本院住院足月分娩。排除標準：（1）資料不完整；（2）合并高血壓；（3）合并其他代謝性疾病，如營養不良、肥胖等；（4）其他內分泌疾病，如甲狀腺功能異常等；（5）主要臟器疾病；（6）嚴重慢性病或傳染性疾病；（7）全身免疫性疾病；（8）曾接受不孕治療，包括體外受精或宮內人工授精等；（9）精神疾病、神志不清、認知功能障礙、溝通障礙；（10）惡性腫瘤。該研究已經過醫院倫理委員會批準，自愿參加研究，并經家屬同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本取材與處理 產婦分娩后立刻在其胎盤母體面小葉處剪取小塊組織，分為四份，聚丁二酸丁二醇酯緩沖液洗凈，置于2 mL 的凍存管內，于-80 ℃下儲存，以10%甲醛固定。

1.2.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑，源于美國Invitrogen 公司；microRNA 分離試劑盒，源于Ambion 公司；逆轉錄試劑盒，源于上海吉瑪制藥技術有限公司；microRNA-103 引物，源于上海吉瑪制藥技術有限公司；聚合酶鏈式反應試劑盒，源于美國PE-Cetus 公司；蛋白抗體，源于Milipore 公司；Tecnai G2 12 透射電鏡（荷蘭FEI 公司）。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應 運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法測定microRNA-103 表達水平，嚴格按照Trizol 試劑盒說明書操作。運用Trizol 法提取胎盤組織的總RNA，運用QuantiMir反轉錄試劑逆轉錄為小RNA 的cDNA（25 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，10 min）。cDNA 運用SYBR Seclect Master Mix 系統進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測microRNA-103 表達，以GAPDH 為內參。microRNA-103 的特異性引物為：上 游5’-CGAGCTCCTCTGAAGCAAAT-3’，下 游5’-AACCTAGCAATGGCACAGAAA-3’。聚合酶鏈式反應體系（20 μL）：cDNA 模板2 μL、上下游引物（25 mmol/L）各1 μL、SYBR Seclect Master Mix 10 μL、ddH2O 0.6 μL；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃34 s；循環40 個。各個樣本均設定3 個復孔，取平均值進行統計分析。為了確保擴增效率的一致性，microRNA-103 的相對表達量以2-ΔΔCT進行計算。

1.2.4 蛋白質印跡法 運用蛋白質印跡法檢測胎盤組織微管相關蛋白1 輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關蛋白5（Atg5）蛋白表達水平。取待測組織蛋白樣本20 μg，添加緩沖液，沸水煮5 min，取出后馬上置于冰上5 min，完成蛋白樣本變性；變性后樣本馬上上樣或放于-80 ℃下保存。制備12%（wt/vol）的SDS 聚丙烯酰胺凝膠；連接垂直電泳裝置。蛋白樣本上樣，在SDS 聚丙烯酰胺凝膠中穩壓（80～110 V）電泳1.5～2.0 h；停止電泳，撤掉電泳裝置，取下凝膠，讓其和聚偏二氟乙烯膜貼合，轉移到轉膜夾層裝置，放在轉膜槽上。根據測定蛋白分子量計算轉膜時間，在電泳200 mA、4 ℃下將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上。停止轉膜后，將膜放于Western 洗滌緩沖液中洗膜2 次，10 min/次，再用含5%脫脂奶粉的Western 洗滌緩沖液于室溫下封閉1～2 h。停止封閉后將膜放在Western 洗滌緩沖液中洗膜3 次，5 min/次。加入稀釋度1∶400 的相應一抗抗體，4 ℃過夜，加入AP 標記的相應二抗抗體IgG（1∶5 000），室溫下孵育2 h。停止一抗孵育后，拿出聚偏二氟乙烯膜，放在Western 洗滌緩沖液中，室溫下洗膜6 次，10 min/次。添加針對一抗的辣根過氧化物酶偶聯的二抗，室溫下放在搖床孵育，輕輕晃動2 h。停止孵育后，以Western 洗滌緩沖液于室溫下洗膜3 次，10 min/次。將孵育好的聚偏二氟乙烯膜置于現配的ECL 工作液中，室溫下溫育2～5 min，于暗室內曝光。運用Image J 軟件對蛋白質印跡結果的灰度值進行數據分析。

1.2.5 電鏡檢測 應用電鏡檢測組織自噬小體。將胎盤組織用聚丁二酸丁二醇酯緩沖液沖洗，用2%戊二醛（聚丁二酸丁二醇酯配制）固定胎盤組織2 h，之后進行傳統透射顯微鏡準備，應用Tecnai G2 12透射電鏡進行檢測。

1.3 觀察指標（1）比較研究組與對照組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達水平。（2）比較研究組與對照組胎盤組織中的自噬小體數量。（3）運用Pearson 相關性分析法分析觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 的相關性。

1.4 統計學處理 運用SPSS 21.0 軟件，計量資料用（）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相關性分析運用Pearson 相關性分析法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 研究組孕婦年齡20～42 歲，平均（29.37±5.98）歲；孕周37～41 周，平均（38.12±1.06）周；體重指數20～31 kg/m2，平均（26.52±2.30）kg/m2；產次0～3 次，平均（1.43±0.52）次；單胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史6 例。對照組孕婦年齡20～42 歲，平均（29.34±6.00）歲；孕周37～41 周，平均（38.10±1.09）周；體重指數20～31 kg/m2，平均（26.55±2.28）kg/m2；產次0～3 次，平均（1.45±0.50）次；單胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史5 例。兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達水平比較 研究組胎盤組織中的microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達水平均高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5蛋白的表達水平比較（）

表1 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5蛋白的表達水平比較（）

2.3 兩組胎盤組織中的自噬小體數量比較 研究組胎盤組織中的自噬小體數量為（83.27±6.30）個，多于對照組的（24.84±1.68）個，差異有統計學意義（t=49.084，P＜0.05）。

2.4 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103的相關性 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 均呈正相關（P＜0.05）。見表2。

表2 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5蛋白與microRNA-103的相關性分析

3 討論

妊娠期間，胎盤會產生胎兒所需的各類激素，而激素分泌的同時也會影響母體胰島素的全身脂解能力及降糖能力，所以會導致妊娠期糖尿病發生風險的升高[14]。隨著孕周增加，孕婦機體中的抗胰島素樣物質會不斷增多，對胰島素的敏感度隨之降低，血糖水平則進一步升高，糖代謝異常因而加重，會形成惡性循環[15]。妊娠期糖尿病對母嬰健康會產生不利影響，嚴重時可危及母嬰生命安全，應引起高度重視，及早診治[16]。

microRNA 是一種由19～23 個核苷酸形成的微小非編碼RNA，普遍存在于真核生物細胞中，是最大的基因家族之一[17]。microRNA 長約20～25 個核苷酸，對基因表達進行轉錄后水平的調控，可通過和靶基因的mRNA3’UTR 配對，直接剪掉靶mRNAs或抑制靶mRNA 的翻譯，繼而發揮調控細胞生物學行為的作用[18]。已有的研究報道指出，microRNA和諸多疾病的發生與發展密切相關，尤其是在癌癥中，幾乎所有癌癥的發生與發展過程均能檢測到microRNA 的異常表達[19]。另有研究報道指出，多種microRNA 在妊娠期糖尿病的發生與發展中發揮著重要作用[20]。microRNA-103 在肥胖型小鼠體內呈高表達狀態，且沉默表達microRNA-103 可改善肥胖型小鼠的葡萄糖穩態，提高胰島素的敏感度。本研究結果顯示，研究組胎盤組織microRNA-103的表達水平高于對照組，提示妊娠期糖尿病胎盤組織中microRNA-103 的表達上調。

自噬是細胞正常的生命現象，在細胞生存中發揮著重要作用。近幾年有研究發現，自噬貫穿于妊娠的整個過程，并參與了滋養細胞的分化、繁衍、侵襲，且維持著胎盤的正常功能與發育[21]。但細胞過度自噬會引起病理妊娠，導致不良妊娠結局的發生，如胎兒生長受限、早產等。LC3-Ⅱ與Atg5 是和自噬相關的兩種蛋白，能夠反映自噬活動。本研究結果顯示，研究組胎盤組織中LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達水平與自噬小體數量均高于對照組，提示研究組胎盤組織的自噬能力增強。相關性分析結果進一步證實，LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 均呈正相關，提示microRNA-103 表達水平與自噬小體形成之間有密切的關聯。因此，microRNA-103 在妊娠期糖尿病中可通過調節自噬參與疾病的發生與發展。

綜上所述，microRNA-103 在妊娠期糖尿病胎盤組織中的表達水平上調，自噬增強，可通過調節自噬參與該病的致病過程。