復方營養混懸劑中維生素E含量測定方法的研究

王 靜，李 瀟，鄧 杰，周長明

（北京市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

復方營養混懸劑是一類基質復雜、有效成分較多的特殊用途藥物制劑，主要用于滿足無法通過正常飲食獲得足夠營養需求的患者、癌癥患者和極低出生體重的嬰兒[1-4]。處方中的有效成分達30余種，其中維生素E有調節機體免疫功能[5]，影響許多與炎癥、細胞存活或凋亡、血管生成、腫瘤發生和衰老等相關的細胞信號傳導途徑[6]，從而改善血液循環，促進新陳代謝，提高機體免疫力，延緩衰老。近年，有關維生素E含量測定的研究報道較多[7-10]，但多是以維生素E為主要成分的制劑，而如復方營養混懸劑這類維生素E所占處方比例相對較低的藥物，相關質量研究的報道較少。為了更好地控制產品質量，本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測定復方營養混懸劑中維生素E的含量。采用此方法可準確測定該品種中維生素E含量，為產品質量控制提供技術支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津公司LC-20AT高效液相色譜儀（LC-20AT泵，SIL-20AC自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列PDA檢測器，Lab-solution工作站）；Mettler Toledo公司XA205電子天平；PALL公司純水機；北京桑翌科技發展有限公司恒溫培養搖床；BUCHI公司Rotavapor R-3真空旋轉蒸發儀。

1.2 試藥

2個廠家6批復方營養混懸劑，企業A批號：1709002，1709003，1709004；企業B批號：180101，180140，190204；維生素E對照品，批號：100062-201811，純度：98.0 %，中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，EMD Millipore公司；石油醚（30～60 ℃）為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱：Merck Hibar 250-4 LiChrosob RP-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μl；理論塔板數按維生素E峰計算應不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取維生素E對照品約25 mg，精密稱定，置入50 ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約5.0 g，精密稱定，加水25 ml，搖勻，置入錐形瓶中，加乙醇25 ml，并精密量取石油醚（30～60 ℃）20 ml，強力振搖15 min，靜置使分層，再精密量取醚層10 ml，40 ℃下于真空旋轉蒸發儀上蒸干后，精密加入甲醇2.5 ml，振搖使殘渣溶解，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系 取維生素E對照品20 mg，精密稱定，置入20 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取儲備液1，2.5，1，1，1 ml，分別置入于100，100，20，10，5 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為0.01，0.025，0.05，0.1，0.2 mg/ml系列對照品溶液。按2.1項色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品濃度X （mg/ml）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=4 083 412.5X+4805.9，r=0.9999。結果表明，維生素E進樣濃度在0.01～0.2 mg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，按2.1項色譜條件連續進樣5針，峰面積和保留時間的RSD分別為0.19 %和0.08 %。結果表明，進樣精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品，按2.2.2項方法制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件進樣，測得含量分別為113.2 %，112.8 %，109.4 %，109.5 %，111.3 %，113.0 %，其RSD為1.57 %。結果表明，本方法重復性良好。

2.3.4 檢測限和定量限 取對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋，按2.1項色譜條件進樣檢測。當進樣濃度為0.45 μg/ml時，信噪比約為3:1，即檢測限為0.45 μg/ml；當進樣濃度為1.75 μg/ml時，信噪比約為10:1，即定量限為1.75 μg/ml。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品5.0 g，分別精密加入維生素E對照品溶液0.15，0.25和0.35 mg，制成低、中、高3個質量濃度的供試品溶液，每個質量濃度制備3份，按2.1項色譜條件進樣，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

2.3.6 專屬性

2.3.6.1 系統適用性試驗 取對照品溶液和供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣，色譜圖見圖1。理論塔板數按維生素E峰計算大于2000。

圖1 系統適用性試驗HPLC圖

2.3.6.2 破壞試驗 取供試品溶液，進行如下破壞試驗：① 堿破壞：取供試品溶液400 μl，加入1 mmol/L氫氧化鈉溶液10 μl，搖勻，室溫放置30 min，再加入1 mmol/L鹽酸溶液10 μl，搖勻；② 酸破壞：取供試品溶液400 μl，加入1 mmol/L鹽酸溶液10 μl，搖勻，室溫放置30 min，再加入1 mmol/L氫氧化鈉溶液 10 μl，搖勻；③ 氧化破壞：取供試品溶液300 μl，加入1 %的過氧化氫10 μl，搖勻，室溫放置15 min；④ 高溫破壞：取供試品溶液在55℃ 放置1 h，放冷至室溫；⑤ 光照破壞：取供試品溶液，在4000 lx下光照24 h，搖勻，即得。分別取破壞后的溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖（圖2）。結果各破壞條件下產生的雜質峰與維生素E主峰達到有效的分離，對測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 破壞試驗HPLC圖

2.3.7 穩定性 取同一份供試品溶液，分別在0，4，8，12，24 h重復進樣測定，記錄峰面積，RSD為1.18 %。結果表明，維生素E供試品溶液在24 h內穩定性良好（室溫避光條件下）。

2.3.8 耐用性的考察 通過調節流速、柱溫和更換不同品牌C18色譜柱，考察維生素E主峰的變化情況。結果表明，維生素E 峰的理論塔板數均大于2000，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取2個廠家6批樣品共12份，分別按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，記錄峰面積。按照外標法計算復方營養混懸劑中維生素E的含量，結果見表2。維生素E含量在90.6 %～109.5 %。

表2 含量測定結果

3 討論

3.1 關于維生素E的問題

維生素E結構復雜，同系物多，在不同行業和不同標準中，其定義也不同[11]。進口腸內營養類藥物質量標準中檢測的維生素E為α-生育酚，分子式是C29H50O2。現行國內復方營養混懸劑質量標準中是以維生素E為標準品，其分子式是C31H52O3。此外，《中國藥典》[12]收載的維生素E原料及制劑均以維生素E計算。本文以現行質量標準中采用的維生素E為對照品，進行維生素E的含量測定研究。

3.2 樣品提取方法的選擇

在進口腸內營養類藥物質量標準中，將維生素E皂化成α-生育酚后進行檢測，前處理過程復雜，不確定因素較多，檢測結果偏差較大。本文采用石油醚一步提取維生素E，避免了反復提取可能造成的損失。實驗中考察了配制供試品溶液時水和乙醇中維生素E殘留量，結果未發現維生素E色譜峰，色譜圖見圖3，說明石油醚提取維生素E效率高。維生素E溶于石油醚中，兩次量取均采用精密量取的方式，能減少不確定因素，達到良好的重復性。

圖3 樣品提取方法考察HPLC圖

3.3 流動相的選擇

維生素E屬于脂溶性維生素，極性弱，一般采用反相液相色譜法分離此類極性較弱的樣品。實驗中分別采用甲醇、甲醇-水（98:2）、甲醇-水（95:5）為流動相，結果表明，增加水相比例，維生素E出峰時間延長，峰型變寬，檢測靈敏度降低。所以選擇純有機相甲醇為流動相，也與現行質量標準中維生素E鑒別項的流動相一致。

3.4 色譜柱的選擇

以甲醇為流動相，考察了維生素E對照品溶液在Merck、Kromasil和Phenomenex 3個品牌的C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的出峰情況。色譜圖見圖4，采用Phenomenex色譜柱時峰形不如其他兩個色譜柱，采用Merck和Kromasil色譜柱時主峰峰形良好，且均能達到理論塔板數要求，其中Merck色譜柱的理論塔板數最高，所以綜合峰型和理論塔板數的要求，最終選擇Merck色譜柱。

圖4 色譜柱考察 HPLC圖

3.5 結論

本文采用高效液相色譜法建立了復方營養混懸劑中維生素E含量測定方法。復方營養混懸劑有效成分繁多，維生素E在處方中的含量較低，需采用有效的前處理方法和靈敏的檢測手段進行測定。本研究建立的方法滿足了含量測定方法學驗證的要求，為復方營養混懸劑中維生素E的質量控制提供了新的技術手段。