產氣克雷伯氏桿菌 Klebsiella aerogenes S2對植物病原真菌的抑菌活性及番茄促生效果

楊淼泠, 王 威, 申乃坤, 李時勇, 黃文善,施李鳴, 姜明國, 張克誠, 葛蓓孛*

(1. 中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;2. 廣西民族大學海洋與生物技術學院, 南寧 530006)

具有“海洋綠肺”美譽的紅樹林(mangrove)是一種典型的生長于熱帶、亞熱帶且兼具海陸特質的生態系統[1]。由于受海水周期性浸淹,紅樹林具有耐高鹽高濕等特性[2]。而生長于此獨特生境的微生物,形成了結構復雜的微生物群落及較高的微生物多樣性,從而使紅樹林生態系統成為挖掘活性菌株的理想寶庫[3]。

1904年,德國學者Hiltner提出“根際”這一概念,它指包含植物根系及根系周圍的土壤微區[4]。由于植物根系不斷向周圍土壤輸送各種脫落物和分泌物,包括死亡的根系細胞(根毛、表皮細胞、根冠等)、可溶性有機酸以及揮發性有機碳等,吸引大量土壤微生物在其周圍生長、繁殖。因此在植物根際周圍形成了種類豐富的根際微生物[5]。其中,植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是植物根際生態系統中的重要組成,在減少生物或非生物對植物的脅迫,維護植物健康生長,增加作物產量等方面發揮著重要作用[6-9]。

目前,有關紅樹林植物根際促生菌已在國內外進行了較為廣泛的探索研究。劉慧杰等采用PCR-DGGE技術揭示了福建九龍江口浮宮紅樹林區細菌多樣性高于非紅樹林區,表明紅樹林沉積物中微生物多樣性豐富[10]。林鵬等通過研究紅樹林土壤微生物分布發現,細菌中以芽胞桿菌居多[11]。Baskar等從紅樹林副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus中分離純化得到對哈氏弧菌Vibrioharveyi 具有強抑制性的抗菌肽類弧菌素[12]。研究發現紅樹林根際土壤中含有豐富的放線菌,并從中發現了具有抗菌促生活性的新型生防菌[13-15]。黃媛林等自廣西紅樹林根際土壤分離得到微小鏈霉菌StreptomycesparvulusMCCG 2008,其具有拮抗植物病原真菌的生防潛力,所產的活性化合物為放線菌素D[16]。何仁發等在根際土壤中找到一株曲霉屬真菌AspergillusochraceopetaliformisF5,能分泌具有較強抗菌活性的發酵產物[17]。王威等從廣西紅樹林中分離篩選獲得一株促進番茄生長的煙草腸桿菌EnterobactertabaciS4[18]。Sengupta等從不同種類紅樹林沉積物、根際及根表分離出多種歸屬于不同種屬的固氮菌,包括固氮螺菌屬Azospirillum、固氮菌屬Azotobacter、根瘤菌屬Rhizobium和梭菌屬Clostridium[19]。在現代綠色農業生產中,微生物菌肥的使用既響應了國家減施化肥的倡導,也維持了土壤安全并提高了作物產量。此外,微生物生防制劑因無毒無害、綠色環保等優點,廣泛應用于綠色有機農業。因此,PGPR的篩選和應用對農業可持續發展具有重大的意義。

本研究從具有豐富根際微生物的紅樹林根際土壤中篩選得到了一株具有促生防病的多功能PGPR菌株,利用分子生物學方法對其進行分類鑒定,以期為新型微生物菌肥的開發提供優質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1土壤樣品的采集

土壤樣品取自我國廣西北海的紅樹林,挖取深度約為2～40 cm的紅樹林根際土壤沉積物,將采集的土壤放置無菌袋中,置于冰盒中低溫保存帶回實驗室后-80℃保存備用。

1.1.2番茄品種

試驗所用番茄品種為‘改良毛粉802’,購自天津市宏程芹菜研究所。

1.1.3供試真菌

尖孢鐮孢Fusariumoxysporum、苧麻疫霉Phytophthoraboehmeriae、麥根腐平臍蠕孢Bipolarissorokiniana、灰葡萄孢Botrytiscinerea、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、蘋果黑腐皮殼菌Valsamali、瓜類炭疽菌Colletotrichumorbiculare、稻綠核菌Ustilaginoideavirens、禾谷鐮孢Fusariumgraminearum、鏈格孢Alternariaalternata、茶藨子新殼梭孢Neofusicoccumribis、禾谷絲核菌Rhizoctoniacerealis、玉米大斑凸臍蠕孢Exserohilumturcicum、葡萄球座菌Guignardiabidwellii、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum、玉蜀黍平臍蠕孢Bipolarismaydis、天門冬擬莖點霉Phomopsisasparagi、稻梨孢Pyriculariaoryzae、黑根霉Rhizopusnigricans由中國農業科學院植物保護研究所農用抗生素研究室提供。

1.1.4主要試劑和培養基

LB培養基用于菌株的富集分離、發酵培養和保存。

DF鹽培養基:MnSO4·7H2O 0.2 g,KH2PO44.0 g,Na2HPO46.0 g,檸檬酸2.0 g,葡萄糖2.0 g,葡萄糖酸鈉2.0 g,組分一與組分二溶液各取0.1 mL,H2O 1 000 mL,pH 7.2。(組分一:CuSO4·5H2O 78.2 mg,MoO310.0 mg,H3BO310.0 mg,ZnSO4·7H2O 124.6 mg,MnSO4·H2O 11.9 mg,溶解于100 mL 滅菌蒸餾水中。組分二:FeSO4·7H2O 100 mg 溶于10 mL滅菌蒸餾水中,充分振蕩)

ADF培養基:把ACC(1-氨基環丙烷-1-羧酸)溶于超純水,用細菌過濾器過濾滅菌,加入到不含有(NH4)2SO4且預先滅菌的DF鹽培養基中,pH 7.2。ACC添加的終濃度為3.0 mmol/L。ADF固體培養基:每1 L ADF培養基中添加瓊脂20.0 g。用于ACC脫氨酶活性菌株的篩選。

生長素產出菌篩選培養基(R2A):酵母粉0.5 g,葡萄糖2.0 g,胰蛋白胨0.5 g,酪蛋白氨基酸0.5 g,可溶性淀粉0.5 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,丙酮酸 0.3 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2。使用時每100 mL R2A 液體培養基與100 μL 50 mg/mL色氨酸溶液混合用于菌株的初篩。

蒙金娜無機磷培養基:葡萄糖10.0 g, (NH4)2SO40.5 g, NaCl 0.3 g, KCl 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·4H2O 0.03 g, 卵磷脂0.2 g, CaCO35.0 g, 酵母膏 0.4 g, 瓊脂 20 g, 蒸餾水1 000 mL, pH 7.0。用于菌株溶磷能力的篩選。

Salkowski試劑[18]:50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3。用于菌株分泌生長素(indole-3-acetic acid, IAA)能力的篩選。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的篩選

菌株的富集及分離:稱取5 g土壤樣品,加入裝有20 mL無菌水的錐形瓶內,于30℃、200 r/min避光振蕩培養30 min,形成懸濁液后,取出靜置分層。取5 mL上清液于30 mL LB液體培養基中,30℃、200 r/min避光振蕩培養24 h。取1 mL懸浮液至50 mL DF鹽培養液中,相同條件下培養24 h,然后再取1 mL懸浮液至ADF培養基中,轉接3次后,用接種環蘸取少量培養液,在ADF固體培養基上劃線分離,30℃培養,待平板上出現單菌落后,挑取單菌落轉接至LB斜面培養基上。

菌株的初篩及純化:將形態不同的單菌落挑取至2 mL含色氨酸的R2A液體培養基的離心管中,于30℃、200 r/min搖床避光振蕩培養24 h,以獲得對應菌株的細菌懸浮液。

具溶磷能力的菌株篩選:取1 μL濃度為1×104cfu/mL 初篩細菌懸浮液涂布于蒙金娜無機磷培養基中,置于34℃恒溫培養箱中避光培養24 h,篩選有溶磷效果的菌株。若單菌落周圍出現溶磷圈,則說明菌株具有溶磷作用,溶磷圈與單菌落直徑比值越大代表該菌株的溶磷作用越強。

具產IAA能力的菌株篩選:將具有溶磷能力的細菌懸浮液12 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液與100 μL Salksowski比色液在96孔板內混合,置于38℃條件下避光保溫30 min,測定OD530。根據IAA標準曲線回歸方程計算菌液中IAA含量。若顯色時顏色變紅,則說明菌株具有產IAA的能力,顏色越深說明該菌株產IAA的能力越強。

平板劃線法對既具有溶磷作用又有產IAA能力的菌株進行純化。將純化后的單菌落移至LB液體培養基中,于30℃、200 r/min避光振蕩培養24 h。將500 μL細菌懸浮液與500 μL 40%甘油混合,置于-80℃保存。分離得到的菌株命名為S2。

1.2.2菌株的鑒定

1.2.2.1形態及生理生化鑒定

觀察菌株S2在LB培養基上的菌落顏色、形態及菌體的形態。按照細菌鑒定常規方法對菌株S2進行革蘭氏染色及生化鑒定試驗[20]。

1.2.2.2分子水平鑒定

將純化后的菌株用 LB 液體培養基培養至對數生長期,離心收集菌體,提取細菌的基因組 DNA,采用通用引物[21](正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增其16S rRNA基因片段。擴增產物經測序后,將序列于 NCBI 中進行BLAST相似性檢索,采用 MEGA-X軟件構建基于16S rRNA序列的系統發育樹。

1.2.3菌株發酵液的制備

將純化的菌株接種至LB固體培養基,置于恒溫培養箱中28℃遮光培養24 h。在無菌條件下取約1 cm2大小的菌餅至100 mL LB液體培養基,28℃、220 r/min振蕩培養24 h。將其分裝于50 mL離心管中于27℃、6 000 r/min離心6 min,取上清即得到發酵液。

取9個無菌離心管,將菌株發酵液依次按10、102、103、104、105、106、107、108、109稀釋倍數進行稀釋,取100 μL稀釋的菌液均勻涂布于LB固體培養基上,做3組平行試驗,恒溫培養箱中28℃避光培養24 h,對菌落數在10～100的平板進行菌落計數,求平均值[8]。將菌株發酵液稀釋為1×107cfu/mL并用0.22 μm細菌過濾器過濾,濾液用于番茄種子發芽試驗和番茄幼苗生長試驗。

1.2.4菌株抑菌活性測定

采用平板對峙法測定菌株對供試病原真菌的拮抗活性。在無菌條件下,打取直徑6 mm的病原真菌菌餅置于PDA平板中央,接種環挑取菌株S2在距平板中央3 cm處劃直線,對照處理組僅接種病原真菌菌餅,每處理3次重復,置于培養箱中27℃避光培養至對照組菌落長至平板的3/4后測量抑菌帶寬度。若有明顯的抑菌帶,則說明S2菌株對該病原真菌具有拮抗作用,且抑菌帶寬度越大,其拮抗作用越強。

1.2.5菌株對番茄種子萌發的影響

選取籽粒飽滿、大小一致的番茄種子,用0.4%高錳酸鉀浸泡10 min進行表面消毒,用無菌水清洗4～6次,置于滅菌濾紙上晾干。將濃度為1×107cfu/mL菌株發酵濾液分別稀釋為1×106、1×105、2×104、1×104、5×103cfu/mL,取5個50 mL無菌離心管,每管放入50粒番茄種子,分別加入10 mL不同濃度的發酵濾液浸泡種子,24 h后將種子整齊擺放于鋪有無菌濕潤濾紙的培養皿中,每處理設3次重復,對照組添加相同體積、相同稀釋倍數的LB液體培養基,再設置一組無菌水對照,置于光照培養箱(28℃，L∥D=16 h∥8 h)培養。每天噴灑少量無菌水以確保種子濕潤。

當胚根與種子等長,胚芽是種子1/2長時視為發芽。以發芽試驗當天記作0 d,8 d后統計發芽勢,10 d后計算發芽率,計算發芽指數和活力指數[7],運用SPSS 20.0軟件進行數據處理。

活力指數V=GP×GI,式中:GP為幼苗的生長勢,本試驗以幼苗平均根質量計算。

1.2.6菌株對盆栽番茄幼苗生長的影響

試驗所用營養基質按營養土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的比例配置,加入適量水拌勻后將其均勻置于穴盤中。在每個穴盤中播3～4粒番茄種子,在種子上面再覆蓋一層薄薄的營養基質,用保鮮膜覆蓋,置于光照培養箱(25℃，相對濕度60%，L∥D=16 h∥8 h)中培養。待番茄幼苗長出2片子葉后去掉保鮮膜,間苗,保留長勢較好的幼苗以備后續試驗。

當番茄幼苗長至兩片真葉時,選取長勢一致的番茄幼苗,測定不同稀釋倍數的菌株發酵液和LB液體培養基對番茄幼苗生長性狀的影響,每個處理20株幼苗,進行3次平行試驗,以施用等量清水為對照。每盆澆灌30 mL,7 d為一循環周期,共灌根5次,最后一次灌根結束后7 d,測定各處理番茄幼苗的根長、株高和鮮質量,其中根長為根莖結合處到番茄根尖的長度,株高為子葉到生長點的長度。最后將番茄幼苗放入烘箱中,60℃烘干后測量干質量。

1.3 數據分析

本試驗采用 MEGA-X軟件進行 Muscle 多序列同源性分析,并利用鄰接法(neighboring-joining, NJ)構建系統發育樹;采用SPSS 24.0(IBM, Armok, NY, USA)統計軟件對番茄農藝指標進行單因素方差分析和LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 廣西紅樹林根際土壤細菌菌株分離結果

前期初篩并純化獲得了10株細菌菌株(表1)。各細菌菌株在蒙金娜無機磷固體培養基中溶磷圈直徑以菌株Gx-Ⅲ2和Gx-Ⅲ15的最大,分別為6.23 cm和6.13 cm。利用IAA標準曲線基于各菌株發生顯色反應后的OD530計算得到其IAA產量,結果表明,菌株Gx-Ⅲ2和Gx-Ⅳ8分泌的 IAA產量相對較高,IAA濃度分別為13.311 μg/mL和9.196 μg/mL。綜合溶磷及分泌IAA能力兩個指標,選取溶磷及產IAA能力均較強的菌株Gx-Ⅲ2進行下一步研究,并將其命名為菌株S2。

表1 廣西紅樹林根際土壤細菌中具溶磷及產IAA能力的菌株篩選

2.2 菌株S2的鑒定

2.2.1形態及生理生化特征

菌株S2在LB培養基上的菌落呈乳白色,圓形,表面光滑、濕潤,革蘭氏染色結果為陰性,菌體桿狀。細菌微量生化鑒定檢測結果表明(表2),菌株S2對吲哚試驗、甲基紅、阿拉伯糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、檸檬酸鹽試驗呈陽性,對葡萄糖、側金盞花醇、乳糖和山梨醇試驗為陰性。

2.2.216S rRNA序列分析

利用所提取的細菌總DNA為模板擴增該菌株的16S rRNA片段,得到了長度為1 300 bp的目的片段(圖1),測序后在NCBI中進行BLSAT相似性檢索,得到同源性較高的菌株,通過構建16S rRNA基因序列系統發育樹(圖2)表明,分離菌株與從土壤中分離得到的產氣克雷伯氏桿菌KlebsiellaaerogenesATCC13048(MW322925)聚為一支,親緣關系較近,一致性達到99%。初步將菌株S2歸屬于克雷伯氏菌屬Klebsiella。

表2 從廣西紅樹林根際土壤分離的細菌菌株S2的生理生化特征1)

圖1 從廣西紅樹林根際土壤中分離的細菌菌株S2 16S rRNA基因片段的擴增Fig.1 Amplification of 16S rRNA gene fragment of bacterial strain S2 isolated from rhizosphere soil of mangrove in Guangxi

圖2 基于廣西紅樹林根際土壤中分離的細菌菌株S2及相關細菌16S rRNA序列的系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of bacterial strain S2 isolated from rhizosphere soil of mangrove in Guangxi and related bacteria strains

2.3 菌株S2的抑菌活性

通過平板對峙培養試驗測定S2菌株對19種植物病原真菌的拮抗效果,結果(圖3)表明,S2菌株對其中3種病原真菌具有不同程度的拮抗效果,對禾谷鐮孢Fusariumgraminearum和茶藨子新殼梭孢Neofusicoccumribis的拮抗作用最強,抑菌帶寬度分別達到0.57 cm和0.55 cm,對玉蜀黍平臍蠕孢Bipolarismaydis的拮抗作用相對較弱,抑菌帶寬度為0.36 cm。對其他16種病原真菌不具拮抗效果。

圖3 廣西紅樹林根際土壤中分離的細菌菌株S2對3種病原真菌的拮抗效果Fig.3 Antagonistic effects of bacterial strain S2 isolated from rhizosphere soil of mangrove in Guangxi against three pathogenic fungi

2.4 菌株S2對番茄種子萌發的影響

S2菌株對番茄種子萌發影響的試驗結果(表3)表明,清水浸種處理后番茄種子發芽率和發芽勢分別為71.33%和60.00%,經S2菌株發酵液稀釋1 000倍 (即1×104cfu/mL)處理后分別達到90.67%和74.00%,高于發酵培養基稀釋2 000倍浸泡處理后的80.67%和62.67%。從發芽指數和活力指數來看,僅有1×104cfu/mL菌株發酵液浸泡后番茄種子的發芽指數和活力指數顯著高于清水對照。因此,當菌株發酵液濃度在1×104cfu/mL時促生效果最佳,隨著濃度的升高,對番茄種子萌發則表現出一定的抑制作用。

表3 廣西紅樹林根際土壤中分離的細菌菌株S2發酵液對番茄種子萌發的影響1)

2.5 菌株S2對盆栽番茄幼苗生長的影響

對菌株發酵液和LB培養基處理后的番茄幼苗根長、株高、鮮質量和干質量等農藝學指標的測定結果表明(表4),S2菌株發酵液稀釋500倍和1 000 倍(即2×104、1×104cfu/mL)與同樣稀釋倍數的LB培養基處理后的番茄幼苗在根長、株高、鮮質量和干質量方面都存在顯著差異。其中菌株發酵液濃度為2×104cfu/mL時對番茄的促生效果最好,其根長、株高、鮮質量和干質量分別7.25 cm、7.19 cm、0.58 g和0.05 g。

表4 廣西紅樹林根際土壤中分離的細菌S2菌株發酵液對番茄幼苗生長的影響

3 結論與討論

PGPR作為植物根際生態系統的重要組成成分,在改善植物營養、促進作物生長、提高肥效藥效和減施化肥農藥等方面發揮著重要的作用。因此,從被認識發現以來一直是國內外科研工作者的研究熱點,也被農業生產者廣泛應用于農、林、園藝以及環境修復等方面。

目前已報道的植物根際促生菌大多屬于芽胞桿菌屬Bacillus和假單胞菌屬Pseudomonas,此外,還包括黃單孢菌屬Xanthomonas、節桿菌屬Arthrobacter、伯克霍氏菌屬Burkholderia、弗蘭克氏菌屬Frankia、固氮菌屬Azotobacter等[6]。本研究從紅樹林根際土壤中分離獲得一株兼具防病促生的細菌菌株S2,經形態、生理生化及分子生物學鑒定為產氣克雷伯氏菌,屬于腸桿菌目Enterobacterales,腸桿菌科Enterobacteriaceae,克雷伯氏菌屬Klebsiella,是革蘭氏陰性菌,在系統發育樹中與產氣克雷伯氏菌K.aerogenesATCC13048親緣關系較近。K.aerogenes最初被劃分于產氣桿菌屬Aerogenes,直到1960年,產氣桿菌屬被重新命名為腸桿菌屬Enterobacter。最近,基于全基因組測序(whole genome sequencing)分析結果,將其重新命名為產氣克雷伯氏菌K.aerogenes[21-25]。目前,國內外未有將產氣克雷伯氏菌作為一種具有防病促生潛力的多功能植物根際促生菌的相關報道。

PGPR的作用機制主要包括活化土壤養分(生物固氮、活化土壤有機氮、難溶性磷和鉀等)、合成植物生長激素(生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯等)、分泌鐵載體以及拮抗病原微生物等[26]。將土壤中難溶性無機磷及有機磷活化并釋放有效磷是PGPR的重要作用機理之一。本研究首次發現產氣克雷伯氏菌S2兼具溶磷和產IAA能力,同時具有較好的促生效果。研究發現,產酶溶桿菌LysobacterenzymogenesLE16能活化土壤中有機磷并促進植物生長[27]。葛春輝等發現,短小芽胞桿菌BacilluspumilusSGM7因具產IAA能力對黃瓜幼苗生長具有顯著的促進作用[28]。PGPR的生防作用是間接促進植物生長的重要原因之一,一般是多種機制共同發揮作用。研究表明,PGPR主要通過產生抗生素、分泌β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)、幾丁質酶(chitinase)等一系列水解酶、誘導系統抗性(induced systemic resistance, ISR)以及與土壤病原微生物競爭營養及生態位等發揮作用,從而有效拮抗病原微生物。Odhiambo等發現產酶溶桿菌L.enzymogenesOH11能分泌一種具有熱穩定性的次生代謝產物,能夠分解禾谷鐮孢FusariumgraminearumPH1的菌絲[29]。沙雷氏菌屬Serratia和芽胞桿菌屬細菌能分泌多種類型的幾丁質酶,作用于病原真菌細胞壁中幾丁質的糖苷鍵,從而抑制病原真菌的生長繁殖[30]。本研究發現產氣克雷伯氏菌菌株S2對多種植物病原真菌具有一定的抑制效果,但對其具體抗病機理還未明確。綜上,本研究豐富了PGPR的種類,為進一步研究開發新型、高效微生物菌肥提供了理論依據,對促進綠色可持續農業生產具有重大的意義。