安徽省太和縣中國南瓜曲葉病毒自然侵染南瓜的檢測分析

陳 瑩, 馬 超, 郭 志, 高正良, 韓科雷,胡淑珍, 嚴丹侃*, 王 芳*

(1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所, 合肥 230031; 2. 安徽果致農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司, 阜陽 236600; 3. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院皖北研究院, 阜陽 236600)

中國南瓜曲葉病毒(squash leaf curl China virus, SLCCNV)屬于雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus。雙生病毒科病毒具有雙聯(lián)體粒體形態(tài),部分為雙分體病毒,其基因組包含DNA-A和DNA-B[1-2]。菜豆金色花葉病毒屬是雙生病毒科9個屬中病毒成員最多、分布最廣且危害最重的一個屬[2],該屬病毒可以廣泛侵染多種作物,包括辣椒Capsicumannuum[3]、番茄Solanumlycopersicum[4]、木瓜Pseudocydoniasinensis[5]和煙草Nicotianatabacum[6]等。中國南瓜曲葉病毒作為Begomovirus中雙組分病毒的代表成員之一,目前在廣西[7]、海南[8]、云南[2]和臺灣[9]均有發(fā)生。在近幾年的報道中,我們發(fā)現(xiàn)SLCCNV的寄主范圍也在逐漸擴大,除了可以侵染南瓜、冬瓜(登錄號:MK064240)、甜瓜[8]、黃瓜、哈密瓜[10]、佛手瓜(EU487031)和西葫蘆等葫蘆科作物[11-12]以外,還可以自然侵染水茄Solanumtorvum[2]。1994年蔡健和等對中國南瓜曲葉病毒的生物學(xué)、血清學(xué)和分子雜交方面進行了相關(guān)研究[13],2001年殷勤燕等首次克隆并測定了中國南瓜曲葉病毒 (SLCV-CHI) DNA-A的全序列[7]。

目前SLCCNV的發(fā)病區(qū)域主要集中在廣東、廣西、海南和云南等中國南部省份,在中國中部和北部則未見報道,此次我們通過對安徽省太和縣南瓜基地的調(diào)查發(fā)現(xiàn),大面積的南瓜葉片發(fā)生皺縮、卷葉和矮化等癥狀,嚴重病株則表現(xiàn)整株壞死,嚴重影響了當?shù)啬瞎系漠a(chǎn)量和品質(zhì)。我們通過對其病葉進行檢測,確定為中國南瓜曲葉病毒。為了進一步明確安徽省太和縣SLCCNV侵染南瓜的發(fā)生情況和遺傳變異等問題,我們利用RT-PCR方法對SLCCNVCP基因序列進行擴增檢測,并將本地的分離物與NCBI上已報道的其他地區(qū)分離物進行系統(tǒng)發(fā)育分析,明確了該地區(qū)SLCCNV的系統(tǒng)進化特征。這是SLCCNV在安徽省的首次報道,本研究結(jié)果將為安徽省太和縣南瓜病毒病害的發(fā)生和防控提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)對策。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年4月-5月,在安徽省太和縣舊縣鎮(zhèn)基地的南瓜溫室中,采集表現(xiàn)出大面積的葉片皺縮、黃化、卷葉、壞死及植株矮化等癥狀的南瓜葉片樣本,同時采集同溫室中的煙粉虱,對樣品進行編號后置于液氮中速凍,保存于-80℃超低溫冰箱。

1.2 檢測方法

1.2.1RT-PCR 檢測

根據(jù)太和縣基地溫室中南瓜葉片的發(fā)病癥狀以及溫室大棚中出現(xiàn)煙粉虱傳毒介體,我們推測其可能受SLCCNV的侵染,因此根據(jù)NCBI中的SLCCNVCP基因序列設(shè)計特異性引物,進行RT-PCR檢測。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。樣品加入液氮充分研磨后,利用SPARKeasy植物基因組DNA快速提取試劑盒提取南瓜葉片總DNA,利用BIOFIT組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取煙粉虱蟲體總DNA。然后利用2×Spark FastTaqMaster Mix (思科捷SparkJade生物有限公司)進行RT-PCR擴增。擴增引物為:上游引物SLCCNV-CP-1F:5′-ATGTCGAAGCGACCAGCCGA-3′;下游引物SLCCNV-CP-1R:5′-TTAATTTGTTACCGAATCAT-3′,擴增CP基因的全序列,長度為771 bp。上游引物SLCCNV-CP-2F:5′-CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTC-3′;下游引物SLCCNV-CP-2R:5′-GTTCTTCACCGTTGCAGTGC-3′,擴增片段為CP基因序列中較為特異的一部分,長度為444 bp。反應(yīng)條件為:94℃ 4 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至通用生物(安徽)股份有限公司測序,測序結(jié)果通過BLAST進行比對。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,使用最大似然法(maximum likelihood)建立親緣關(guān)系進化樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 安徽省太和縣南瓜基地SLCCNV發(fā)生情況

本研究對安徽省太和縣舊縣鎮(zhèn)南瓜溫室進行了調(diào)查分析,我們發(fā)現(xiàn)溫室內(nèi)南瓜病毒病發(fā)生較為嚴重,并出現(xiàn)煙粉虱等傳毒介體,受病毒侵染的南瓜葉片苗期主要表現(xiàn)為皺縮、曲葉、畸形、壞死,生長后期植株葉片向上嚴重卷曲、皺縮、植株矮化,嚴重時不結(jié)果實。典型癥狀如圖1所示。

2.2 安徽省太和縣南瓜基地SLCCNV的RT-PCR檢測

將采集的4株具疑似病毒癥狀的葉片樣品進行病毒檢測,根據(jù)合成的2對SLCCNVCP基因特異性引物進行RT-PCR驗證,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),采集的4株樣品中,均檢測出目的條帶,條帶大小分別為771 bp和444 bp(圖2a、b)。此外,將采集的煙粉虱蟲體混合后分成3組,用SLCCNV-CP-2F/R特異性引物檢測,均擴增出相應(yīng)條帶,電泳檢測結(jié)果如圖2c所示。PCR產(chǎn)物測序后經(jīng) NCBI BLAST(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后,確定為中國南瓜曲葉病毒。本試驗在南瓜上檢測到的SLCCNVCP基因序列全長771 bp,編碼256個氨基酸。該分離物CP核苷酸序列與NCBI上登錄號為MW389919的CP核苷酸序列相似性高達99.35%,與登錄號為MW389917、MF062251和HM566112這3個CP核苷酸序列相似性達90%以上,與其他地區(qū)已報道的分離物核苷酸序列相似性在90.01%～99.35%之間。這是安徽省關(guān)于SLCCNV自然侵染南瓜的首次報道。

圖1 安徽省太和縣SLCCNV侵染南瓜的典型癥狀Fig.1 Typical symptoms of pumpkin infected by SLCCNV in Taihe, Anhui province

圖2 安徽省太和縣南瓜葉片和煙粉虱蟲體中SLCCNV CP基因的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR detection of SLCCNV CP in pumpkin leaves and Bemisia tabaci in Taihe, Anhui province

2.3 安徽省太和縣南瓜基地SLCCNV的CP序列系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)NCBI已登錄的序列和相關(guān)文獻報道,目前SLCCNV的自然寄主主要是葫蘆科作物(南瓜、甜瓜、冬瓜、黃瓜、佛手瓜、西葫蘆等),主要分布在中國(廣東、廣西、海南和云南)、印度、越南、泰國、菲律賓、巴基斯坦和馬來西亞等國家[15-19]。為了明確安徽省太和縣南瓜SLCCNV的分類地位以及與各地區(qū)所報道的該種病毒不同寄主之間的親緣進化關(guān)系,將檢測到的SLCCNVCP基因序列與已報道的34個SLCCNVCP基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,SLCCNV主要分為2個大的分支,其中一個分支主要是來自印度和孟加拉國的分離物;另外一個分支是其他國家(越南、泰國、柬埔寨、菲律賓和馬來西亞)以及中國各地區(qū)(廣東、廣西、海南、云南)的分離物,包括此次在安徽太和縣檢測到的分離物也處于這一分支上。此外,來自泰國的分離物主要聚集在一個分支上,來自其他地區(qū)如云南的分離物同樣如此,說明SLCCNV不同地區(qū)的分離物存在明顯的地域性分布和差異。本次檢測到的安徽太和SLCCNV的分離物與廣東和海南地區(qū)分離物親緣關(guān)系較近,與國外的親緣關(guān)系相對較遠,也進一步表明中國各地區(qū)SLCCNV的分離物變異性較小。

圖3 基于中國南瓜曲葉病毒CP序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法)Fig.3 Phylogenetic tree based on the CP of SLCCNV by Maximum likelihood method

3 結(jié)論與討論

植物病毒病是植物生產(chǎn)上的重要病害,而雙生病毒是植物病毒中較為重要的一類,其中SLCCNV作為雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬的重要代表成員,在葫蘆科作物的生產(chǎn)上造成了嚴重的危害和經(jīng)濟損失。目前據(jù)報道SLCCNV也可以侵染茄科作物水茄Solanumtorvum[2],說明該病毒的寄主范圍也在逐漸擴大,可以在植物的不同科之間進行侵染和傳播,同時在侵染的過程中也可能存在某些程度上的變異進而對作物造成更大的危害。本研究對安徽太和縣采集的南瓜樣品進行了RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)4株樣品均受SLCCNV侵染,且侵染葉片在田間主要表現(xiàn)為卷曲、皺縮、黃化以及植物矮化等癥狀,發(fā)生嚴重時整個溫室大棚絕收,給農(nóng)戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失。通過對SLCCNVCP基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),安徽太和地區(qū)的SLCCNV分離物與廣東和海南的親緣關(guān)系最近,與泰國的分離物處于一個大的分支上,而與印度和孟加拉國的分離物親緣關(guān)系較遠,處于不同的大分支,這一結(jié)果與2017年車海彥等的研究結(jié)果有相似之處[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,中國云南地區(qū)的分離物與泰國地區(qū)的分離物親緣關(guān)系較近,與中國其他地區(qū)的分離物親緣關(guān)系較遠,說明即使是不同國家(中國云南和泰國)的分離物也會具有較近的親緣關(guān)系,這可能與SLCCNV基因組不同位置的進化速度,寄主和地域差異等因素有關(guān),但仍需進一步驗證。

病毒病的發(fā)生和流行是由病原、寄主植物和傳播介體三者共同造成的,缺一不可。而本研究中SLCCNV的自然寄主是南瓜等葫蘆科作物,其主要的傳毒介體是煙粉虱,因此當氣候與溫度適宜時,易造成煙粉虱的快速繁殖與發(fā)育,從而造成該病毒病的流行。2020年閆明輝等從雙生科病毒、介體昆蟲煙粉虱以及寄主植物三者之間蛋白互作角度,總結(jié)了煙粉虱傳播植物病毒相關(guān)蛋白的研究進展[20]。盧丁伊慧等2020年報道了煙粉虱的為害特點及防治方法[21]。因此有效控制煙粉虱的傳播對于該病毒病的防治是一個重要的手段和策略。

本研究表明安徽太和縣SLCCNV與已報道的來自中國的SLCCNV基因組核苷酸和氨基酸序列相似性較高,說明該病毒在我國變異較小,可能與該病毒是現(xiàn)代從國外某地區(qū)侵入我國有關(guān)。因此,我們需要建立多個瓜類蔬菜種植地區(qū)的聯(lián)合綠色防控體系,保障南瓜安全生產(chǎn)。