廣西南寧避雨栽培葡萄炭疽病的病原菌鑒定

譚海蕓, 吳林娜, 張 瑋, 周詠梅, 李興紅*

(1. 中國農業大學植物保護學院, 北京 100193; 2. 北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點實驗室, 北京市農林科學院植物保護環境保護研究所, 北京 100097; 3. 廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所, 南寧 530007)

‘陽光玫瑰’(Shine Muscat)是一個歐美雜交葡萄品種,對霜霉病、白粉病具有較好的耐病性,而對炭疽病則較為感病[1],目前在我國云南、廣西、浙江等地廣泛種植[2]。

葡萄炭疽病(grape anthracnose)是葡萄栽培過程中的重要病害之一,主要危害著色期或近成熟期的果實[3],降低葡萄的產量和品質。美國學者Southworth于1891年首次對葡萄炭疽病進行了描述[4],我國最早于1988年-1991年間對其發生和防治進行了研究[5]。引起葡萄炭疽病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum的17個種,目前在我國已報道的有10種,分別為隱秘炭疽菌Colletotrichumaenigma、河北炭疽菌C.hebeiense[6-7]、C.ampelinum[8]、辣椒炭疽菌C.capsici[9]、C.citri、果生炭疽菌C.fructicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioide、睡蓮炭疽菌C.nymphaeae[7]、平頭炭疽菌C.truncatum[10]、C.viniferum[6-7,10-12]。其中C.ampelinum、C.citri、C.hebeiense和C.nymphaeae4個種僅在我國有相關報道。2013年,Peng等[11]首次報道C.viniferum引起葡萄炭疽病。目前,C.viniferum在我國云南、貴州[11]、北京、山東、河北、江蘇、新疆[6]、福建、浙江、四川、江西、河南[12]等12個省市自治區有引起葡萄炭疽病的報道,是葡萄炭疽病的主要病原菌之一,而國外僅有日本[13]和韓國[14]兩個國家有相關報道。

避雨栽培措施的推廣應用有效地控制了葡萄炭疽病的發生,使露地栽培葡萄發生重的炭疽病基本消失[15]。然而,2020年廣西部分地區避雨栽培的葡萄出現了較為嚴重的炭疽病,引起了種植者的關注。為明確引起該病害的病原菌,本研究對廣西地區避雨栽培條件下發生炭疽病的‘陽光玫瑰’葡萄進行調查和采集病樣,并在室內進行了病原菌的分離鑒定,旨在為了解和防治廣西地區葡萄炭疽病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病害調查與病樣采集

2020年10月,對廣西南寧明陽基地避雨栽培的‘陽光玫瑰’葡萄園炭疽病發生情況進行了調查,并采集具有典型葡萄炭疽病癥狀的果實病樣3份,將其帶回實驗室進行病原菌的分離鑒定。

1.2 病原菌的分離與純化

采用單孢分離法[16]對具有典型癥狀的炭疽病果進行病原菌分離。直接從果實表面發病部位溢出的粉紅色黏液(分生孢子團)中挑取分生孢子制成孢子懸浮液,調到適當濃度后,用涂布器將其均勻涂于1.5%水瓊脂平板表面。在25℃恒溫培養箱中培養12 h左右,置于顯微鏡下觀察并用金屬針挑取單個孢子,轉接到PDA平板上培養,然后轉至經滅菌的PDA斜面凍存管中,培養7 d后4℃保存備用。

1.3 病原菌的形態學鑒定

在PDA平板上接種分離純化后的單孢菌株,于25℃、L∥D=12 h∥12 h條件下培養,采用十字交叉法連續6 d測量菌落直徑,計算生長速率,每個菌株重復3次;定期觀察病原菌菌落形態,待菌落長滿整個培養皿后拍照記錄菌落的形態和顏色。產孢后在顯微鏡下觀察孢子和附著胞形態,并對其大小進行測量,根據形態學特征初步鑒定病原菌種類。

1.4 系統發育分析

單孢系菌株在PDA平板上培養7 d后用滅菌牙簽刮取菌絲,采用CTAB法提取病原菌的基因組DNA,用表1引物進行PCR擴增[12,17]。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至北京擎科生物技術有限公司進行測序。在NCBI數據庫(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中對測序結果進行BLAST比對分析,查找并下載相關種的模式菌株參考序列。在BioEdit 7.0.9.0軟件上對各菌株的序列進行校正,校正后的序列按照ACT、GAPDH、ITS、TUB2、和CAL的順序進行拼接,然后在CIPRES Science Gateway網站(https:∥www.phylo.org/portal2/login!input.action)上利用最大似然法(maximum likelihood, ML)構建多基因系統發育樹[18]。

表1 用于本研究的引物

1.5 致病性測定

將分離的菌株接種在PDA培養基上,于25℃恒溫培養箱培養5 d后,用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅(d=4 mm)備用。依據柯赫氏法則,選取健康、大小一致的‘陽光玫瑰’葡萄果實,采用刺傷處理和無傷處理兩種方法進行接種。將果實用流動自來水沖洗干凈,用經75%乙醇處理的剪刀將果實剪下,保留果柄,在75%乙醇中消毒30 s,再用無菌水沖洗3次,置于滅菌的濾紙上自然晾干。刺傷處理采用滅菌的昆蟲針造成微傷口,然后將準備好的菌餅接在傷口處;無傷處理直接將菌餅接于葡萄果實上,以無菌PDA塊作對照處理。每個菌株接9個果實,重復3次。將接種的果實放于恒溫(25±1)℃接種室中培養,期間用加濕器進行加濕,定期觀察并記錄果實發病情況。對發病果實進行病原菌的再分離,完成柯赫氏法則驗證。

2 結果與分析

2.1 病害調查與病原菌分離

圖1 葡萄炭疽病在田間及果實上的癥狀Fig.1 Symptoms of grape anthracnose on grape berries

通過田間調查發現,2020年廣西南寧明陽基地葡萄炭疽病病穗率高達70%～80%,產量損失達50%。該病在田間主要危害果實(圖1a),受侵染的果實初期在果實表面形成黑褐色小斑點,后逐漸擴大為近圓形病斑(圖1b),有的表皮開裂,發病部位略凹陷(圖1c),病斑表面出現輪紋狀排列的小黑點(分生孢子盤),天氣潮濕時,小黑點變成粉紅色的黏狀物(分生孢子團)(圖1d)。嚴重時,病斑擴展到半個甚至整個果面,通常整個果穗的大部分果粒受害,果粒腐爛,脫落或干縮形成僵果(圖1d)。通過單孢分離獲得4個菌株JZB330315～JZB330318。

2.2 病原菌的形態鑒定

在PDA培養基上,4株菌株的形態學特征相似。菌落正面灰白色,背面淡橘黃色,邊緣白色(圖2a)。氣生菌絲致密,生長速率為3.2～12.1 mm/d(平均:7.9 mm/d±2.7 mm/d,n=20)。培養后期接種點可見粉紅色的黏狀分生孢子團(圖2b)。附著胞單胞,深棕色,形狀不規則,通常內有顆粒物,大小為(9.77±2.61)μm×(6.19±1.47)μm(n=24),當分生孢子萌發時可能形成隔膜(圖2c),分生孢子單胞,無色,光滑,圓柱形,兩端鈍圓,內有顆粒物,有時具油球,大小為(16.08±1.08)μm×(5.37±0.48)μm(n=70)(圖2d)。根據形態學特征初步鑒定該菌為C.viniferum[14]。

圖2 Colletotrichum viniferum在PDA平板上的形態學特征(JZB330318)Fig.2 Morphological characteristics of Colletotrichum viniferum (JZB330318)growing on PDA

2.3 病原菌的系統發育分析

將供試菌株(JZB330315～JZB330318)的ACT、CAPDH、ITS、TUB2、CAL序列提交至GenBank,獲得登錄號ACT(MZ557369～MZ557372)、GAPDH(MZ557377～MZ557380)、ITS(MZ557357～MZ557360)、TUB2(MZ615727～MZ615730)、CAL(MZ557373～MZ557376)。以C.trichellum為外群,基于最大似然法(ML)對4個菌株及其所在屬的其他菌株構建多基因系統發育樹。結果顯示,4個菌株均與C.viniferum聚為一支,自舉支持率為100%(圖3)。

圖3 基于ACT、GAPDH、ITS、TUB2和CAL等5個基因利用最大似然法(ML)對炭疽菌屬和相關分離菌株構建多基因系統發育樹Fig.3 Maximum likelihood phylogenetic tree based on combined ACT, GAPDH, ITS, TUB2 and CAL sequences of Colletotrichum species and related isolates

2.4 致病性測定

隨機選取兩個菌株(JZB330316和JZB330318)進行致病性測定,兩個菌株在刺傷接種5 d后觀察到接種部位出現圓形病斑,無傷處理和對照處理葡萄果實上沒有觀察到病斑產生;接種7～9 d,刺傷處理病斑擴大并凹陷。無傷處理菌株JZB330318接種7 d后開始出現病斑,菌株JZB330316接種9 d左右開始出現病斑,后病斑逐漸擴大并凹陷,對照處理未發病(圖4),2個菌株接種結果比較發現,菌株JZB330318的致病力強于菌株JZB330316。對接種發病的果實進行病原菌的再分離,分離得到的菌株與原菌株形態特征一致。

圖4 Colletotrichum viniferum(JZB330316和JZB330318)接種離體果實9 d后的發病情況Fig.4 The incidence of Colletotrichum viniferum (JZB330316 and JZB330318)inoculated with vitro fruits for nine days

3 討論

目前C.viniferum在我國多個省份可引起葡萄炭疽病,是我國葡萄炭疽病的主要病原菌之一。本研究依據形態及系統發育分析,將引起廣西南寧地區避雨栽培葡萄炭疽病的病原菌鑒定為C.viniferum,是首次在廣西發現C.viniferum引起葡萄炭疽病。然而,在我國引起葡萄炭疽病的病原菌有隱秘炭疽菌Colletotrichumaenigma、果生炭疽菌C.fructicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioide等10余種,因此該地區是否存在其他種的炭疽病病原菌尚不清楚,需要在今后進行進一步的研究。

炭疽病的發生與環境條件密切相關,高溫、潮濕多雨天氣有利于病害發生[3]。調查發現,該葡萄園前期未能及時割除雜草,葡萄園通風差,微氣候條件適合葡萄炭疽病發生;加上‘陽光玫瑰’葡萄品種本身較易感炭疽病[2],2種原因綜合起來可能導致2020年明陽基地‘陽光玫瑰’葡萄在避雨栽培條件下炭疽病嚴重發生。在之后的栽培管理中應注意改善田間小氣候,及時割草,并結合藥劑防治,減少葡萄炭疽病的發生。