閩南地區(qū)21例罕見地中海貧血基因突變分析

藍惠華 潘燕如 張夢情 黃榕 張玲

陸軍第七十三集團軍醫(yī)院廈門大學附屬成功醫(yī)院檢驗科，廈門 361003

地中海貧血（又稱地貧）是全球最常見的遺傳性疾病之一，由α-珠蛋白和β-珠蛋白基因組突變引起。地貧主要分布在地中海、非洲、中東地帶、印度和東南亞的沿海地區(qū)［1］。在中國，地貧主要散布在中國南方，特別是廣西、廣東和海南，福建區(qū)域也有一定的地貧基因的攜帶量，尤其是毗鄰廣東的閩南地區(qū)［2-4］。重型地貧患者往往胎死子宮內(nèi)或嬰兒早期死亡，而中型地貧患者則往往表現(xiàn)為終身貧血，且必須長期輸血和祛鐵治療，給家人和社區(qū)帶來了很大壓力［5］。所以，地貧攜帶者的檢測和產(chǎn)前診斷，對減少地貧高發(fā)區(qū)域內(nèi)的地貧病死率必不可少。目前，針對我國南方人群常見類型α、β地貧的檢測，市面上通用的幾種地貧基因檢測試劑盒基本上都能涵蓋，不過，由于地貧基因的分子基礎相對復雜、突變種類眾多，在臨床工作中也會碰到一些血液學表型與基因突變檢測結果明顯不相符，可能存在罕見突變基因的例子［6］。我們收集了2017年11月至2022年5月來廈門大學附屬成功醫(yī)院就診的38例臨床血液學檢測異常但常規(guī)地貧基因突變檢測結果陰性，可能含有罕見地貧基因突變的樣本38份，使用了跨越斷裂點聚合酶鏈反應（GAP-PCR）和電泳、基因測序檢查方法對其進行了檢測評價，用以進一步明確診斷并逐步擴充本地區(qū)的地貧基因突變譜。

資料與方法

1、一般資料

收集了2017年11月至2022年5月來廈門大學附屬成功醫(yī)院就診的臨床血液學檢測異常但常規(guī)地貧基因突變檢測結果陰性的患者38例，其中男16例，年齡5～47歲；女22例，年齡15～56歲。38例樣本分別來自福建閩南地區(qū)的9個不同地方，包括廈門思明區(qū)、廈門同安區(qū)、漳州龍海區(qū)、漳州薌城區(qū)、漳州云霄、漳州詔安、泉州晉江、泉州安溪、泉州石獅。樣本采用EDT A-2K抗凝的真空管靜脈血2 ml，在4℃環(huán)境下郵寄送至廣東凱普生物有限公司進行測序分析。患者已在廈門大學附屬成功醫(yī)院進行了血液學分析、血紅蛋白電泳分析和地貧常規(guī)基因突變的檢測。上述樣本的測序檢測與廣東凱普生物有限公司合作完成。全部的檢測都通過受試者的知情同意，并簽訂了知情同意書。罕見α-地貧的納入標準［7］：血紅蛋白H（Hb H）病表型而基因型僅為標準型的患者；生育過Hb H病患兒而基因型正常的父母；非缺鐵性的小細胞低色素貧血，基因型正常的患者。罕見β-地貧的納入標準［7］：血紅蛋白（Hb）電泳HbA2＞3.5%，且呈小細胞低色素貧血而基因型卻是正常的患者；重型地貧表型而基因型僅為攜帶者的患者。

2、檢測方法

血液學常規(guī)分析采用深圳邁瑞CAL8000自動化血細胞分析流水線及其配套試劑進行檢測；血紅蛋白電泳運用HYDRASYS 2全自動電泳儀進行分析；運用Veriti Dx96聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀及HHM-2醫(yī)用核酸分子快速雜交儀，對常見的3種α-地貧缺失基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3種α-地貧突變基因（CS、QS、WS）及IVS-II-654（C-T）、-28（A-G）、-29（A-G）、CD14∕15（+G）、CD17（A-T）、CD27∕28（+C）、βE（G-A）、CD41∕42（-TTCT）、CD43（G-T）、CD71∕72（+A）、IVS-I-1（G-T，G-A）、IVS-I-5（G-C）、Cap（-AAAC）、Int（T-G）、CD31（-C）等15個β-地貧基因突變位點通過GAP-PCR方法、PCR擴增和導流雜交的原理實現(xiàn)［8］。全血DNA提純、PCR擴增和PCR產(chǎn)物雜交均采用由廣東凱普生公司提供的試劑盒，嚴格規(guī)定遵照操作程序執(zhí)行各項檢測。

α及β地貧的測序分析利用Sanger雙去氧鏈終止法完成，先利用外周血中DNA提取試劑盒抽取基因組DNA，再利用GAP-PCR技術測定缺失型α及β地中?；颍瑢CR的擴增物質采用瓊脂糖凝膠電泳，確定得到目的片段后，再將擴增產(chǎn)物與之對應的引物，送到廣州凱普公司進行測序技術分析，在完成測序技術后，通過與http：∕∕blast.ncbi.nlm.nih.Gov∕對比，分析測序圖紙，以判斷是否有新突變位點的存在，擴增引物和反應條件參照文獻［6］。

結 果

38例可疑為罕見地貧的樣本中檢出21例為稀有類型地貧，當中包含了6種罕見的α珠蛋白基因突變，分別為8例泰國型缺失（--THAI）、2例中國香港型缺失（HKαα）、2例菲律賓型（--FIL）、1例CD 30（-GAG）、1例CD 122 CAC＞CAG，WSM和1例αα∕αααanti4.2；其中2例--FIL源于一對母子。6種罕見β珠蛋白基因突變，分別為2例IVS I-129 A＞G雜合突變、1例CD56 GGC＞GAC雜合突變、1例CD54 GTT＞GTC，Val＞Val雜合復合Terminal CD+32 A＞C雜合突變、1例113A＞G（Poly A（A＞G）AATAAA＞AATAAG）雜合突變，1例越南型（Vietnamese）遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）缺失型β地貧，其中CD54 GTT＞GTC雜合突變以往未見報道，其測序圖見圖1。21例罕見地貧的基因突變詳見表1。

圖1 CD54 GTT＞GTC雜合突變測序結果

表1 21例罕見地貧的基因突變類型

討 論

本研究通過對38例疑似罕見地貧患者的血液樣本進行測序分析，共發(fā)現(xiàn)21例罕見型地貧，陽性率高達55.26%，其中α-地貧15例，α地貧以--THAI最常見（占53.33%），其次是--FIL和HKαα。α地貧在整個東南亞很常見，最常見的原因是16號染色體短臂上α珠蛋白基因簇的不同DNA片段缺失，該基因復合體包括2個α基因（α2和α1）、1個胚胎基因（ζ2）、幾個假基因（ψα1、ψα2、ψζ1）和1個功能未知的基因（θ1），順序為5’-ζ2-ψζ1-ψα1-ψα2-α2-α1-θ1-3’［19］。在整個熱帶和亞熱帶地區(qū)，2個α基因（αα）中的1個缺失（-α）是常見的，而涉及2個α基因（--）的缺失最常見于東南亞和地中海盆地，即Hb H?。?-∕-α）和Hb Barts胎兒水腫綜合征（--∕--）的高發(fā)地，在東南亞，以--SEA缺失型最常見，它是約20 kb長度的α基因簇的缺失，即α1和α2基因完全缺失，僅保留ζ2和ψζ1基因不變［19］。然而在泰國和菲律賓地貧患者中首次發(fā)現(xiàn)其中一條染色體上的ζ-α復合體完全缺失，因而分別稱之為--THAI和--FIL，由于這些缺失延伸到5’端的ζ基因之外和3’端的α基因之外，它們位于θ1基因之外的一個小序列DNA區(qū)域附近，該區(qū)域被命名為a-珠蛋白3'高變區(qū)（3'HVR），因此通過珠蛋白復合物的常規(guī)限制性圖譜，不能在雜合子（--∕αα）中明確識別它們，因此在遺傳咨詢和產(chǎn)前檢測期間可能會遺漏這些缺失［9］。--THAI和--FIL這2個缺失被定位到5’斷點的ζ2珠蛋白基因上游約4 kb的區(qū)域，--FIL缺失30～34 kb，--THAI缺失長度為34～38 kb，與3'HVR不同的是，用于識別5'斷點的探針可識別對2種突變中的每一種都具有特異性的獨特片段，并可用于常規(guī)產(chǎn)前檢測［9］。與--SEA相比，--THAI和--FIL突變在Hb H疾病和Hb Bart胎兒水腫綜合征受試者中相對少見或表達不足，需要進行更廣泛的研究，以確定其在這些人群中的真實頻率。--THAI或--FIL突變的純合子中可以產(chǎn)生由ε4或γ4制成的血紅蛋白，這兩者都不可能支持發(fā)育中胚胎和胎兒的氧氣需求，因此，受影響父母的后代（--∕αα）很可能出現(xiàn)高頻率的早期自然流產(chǎn)，這些突變體的復合雜合子和常見的東南亞決定基因（--FIL∕--SEA或--THAI∕--SEA）也會患有Hb-Bart胎兒水腫綜合征，并且在早期胚胎和胎兒生命中也可能受到嚴重損害，因為只有一個功能性ζ-珠蛋白基因，這也可能導致早期流產(chǎn)。在東南亞人群中的“高?！狈驄D中鑒定這些突變體尤為重要，尤其是采用常規(guī)方法無法鑒定識別的--FIL∕αα和--THAI∕αα攜帶者。本研究發(fā)現(xiàn)2例HKαα。HKαα異?；蛐鸵?005年在中國香港首次報道檢出而命名，是一種極少見的在α-珠蛋白基因簇同源區(qū)域錯位與減數(shù)分裂過程中的發(fā)生的不平衡交叉連接，它同時含有-α 3.7缺失及αααanti4.2基因等位基因的交叉連接片段，HKαα的基因組成成分有1個α2基因和1個由α2和α1部分片段組成的融合基因（即右缺失片段）［10，20］。HKαα等位基因既不包含缺失，也不包含三倍體，因此這種等位基因的攜帶者不太可能受到任何有害影響，其血液學和臨床表現(xiàn)都是正常的。然而，這種重排在個體中的存在對于基于PCR的α地貧分子診斷具有重要意義，臨床采用的常規(guī)檢測方法只能檢測-α3.7缺失，不能檢測到αααanti4.2，因而常常誤診為-α 3.7∕--，而導致產(chǎn)前咨詢時誤導臨床給出錯誤的建議。

本研究檢出1例αα∕αααanti4.2基因型。根據(jù)αααanti4.2基因的分子生物學特性，這個基因的載體表達的α鏈比野生型個體多，這將導致比野生型個體更多的α鏈合成，從而導致α鏈與β鏈的比例失衡［10］。當個體僅攜帶αααanti4.2基因時，α鏈與β鏈的比率略有不平衡，攜帶者不會遇到嚴重問題，然而，當它們同時攜帶β地貧等位基因時，合成α鏈與β鏈的比率進一步失衡，導致不同程度的貧血。大多數(shù)臨床機構使用的常規(guī)檢測試劑的檢測范圍不包括αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα基因，因此，很難常規(guī)檢測這些變化，由于檢測方法的復雜性，以往的研究沒有充分研究這些變異在人群中的攜帶情況，大多數(shù)檢測機構也沒有對其予以重視。

本研究檢出1例CD 30（-GAG）突變，該突變?yōu)閍2基因外顯子1的密碼子30缺失，即α2基因編碼序列的91-93號堿基GAG缺失，然而，這并不影響該區(qū)域的剪接位點一致性序列，因為外顯子的最后2個核苷酸（AG）和中間序列中的前6個核苷酸保持完整，這種框內(nèi)缺失導致少1個氨基酸的α珠蛋白鏈，截短的蛋白質高度不穩(wěn)定，因新合成的珠蛋白鏈分子疏水性增加，會被蛋白質水解迅速破壞，除非它們被并入Hb四聚體中［11］。CD 30（-GAG）為致病性突變，臨床表型為α?或α0。本研究檢出1例Hb Westmead，這是由HBA2密碼子122（CAC＞CAG）突變引起的a鏈變體，是一種沉默的非缺失的a+-地貧，其a-珠蛋白鏈缺失程度比缺失型a+-地貧輕［12］。Hb Westmead在中國南方很常見。據(jù)報道，在廣西省，Hb Westmead的等位基因頻率為1.55%，其次是Hb CS（1.21%）和Hb QS（0.36%）［21］。然而，這種變體不如其他常見的非缺失型α-地貧如Hb-CS和Hb-QS那樣廣為人知，原因可能是Hb Westmead僅與輕度α-地中海表型相關，再則在常規(guī)電泳或高效液相色譜（HPLC）上無法檢測到這種變體，因而常常被忽略。

β-地貧是世界上最常見的單基因疾病之一，其特征是血紅蛋白的β-珠蛋白鏈合成減少或缺失，嚴重的β-地貧會導致嚴重的貧血，需終生輸血。突變類型與臨床表現(xiàn)高度相關，在世界不同地區(qū)已經(jīng)描述了200多個導致β-地貧的突變［22］。盡管每個人群中發(fā)現(xiàn)的這些突變數(shù)量相對較少。在中國人群中，常見的幾種突變占所有病例的90%以上，而罕見突變對于受影響家庭的產(chǎn)前診斷也很重要，對于深入了解珠蛋白基因調控的潛在過程以及基因型-表型關系的研究也不可或缺。本研究檢出罕見β-地貧6例。

IVS I-129 A＞G突變（HBB：c.93-2A＞G）是β基因編碼區(qū)序列的271號堿基G突變?yōu)門，對應的編碼氨基酸由谷氨酸改變?yōu)榻K止密碼子，為致病性突變，臨床表型為β0，在德國首次報道［23］。本研究發(fā)現(xiàn)2例該突變，且2例非親緣關系。CD56 GGC＞GAC突變，即Hb J-Bankok，由β-珠蛋白鏈56位的甘氨酸由天冬氨酸取代而定義，這種突變似乎產(chǎn)生了一種帶有額外負電荷的β亞單位變體，因為β56（D7）Asp鏈有更多機會與帶正電荷的α鏈結合，與正常β鏈競爭，從而允許在雜合子狀態(tài)下形成比正常Hb A更多的Hb J-Bankok，這種Hb變體顯示出快速的電泳遷移率［14］。Hb J-Bankok無臨床癥狀。本研究檢出1例，該突變者，血紅蛋白電泳檢出異常血紅蛋白所占比例高達51.3%。Terminal CD+32 A＞C突變在福建及廣東廣州均有報道為β基因3'端非編碼區(qū)域的32號堿基A突變?yōu)镃［16，24］。該突變使β珠蛋白基因型轉錄效率降低，mRNA穩(wěn)定性低于正常水平，影響正常的β珠蛋白鏈的合成，為致病性突變，臨床表型為β+，由于病例數(shù)的局限性，該突變的致病性有待獲取更多病例后再進一步研究確認。本研究中檢出的Terminal CD+32 A＞C突變患者同時檢出一種以往未見報道的突變類型，即HBB：c.165T＞C（CD54GTT＞GTC，Val＞Val）突變，該突變是β基因編碼區(qū)序列的165號堿基T突變?yōu)镃（圖1），對應的54位編碼氨基酸為纈氨酸未發(fā)生改變，不影響β珠蛋白的合成，理論上不引起相關的臨床癥狀，該突變對人體是否有其他影響及其詳細機制有待進一步研究確認。

HBB：c.*113A＞G突變位于HBB基因轉錄的起始位點上游啟動子區(qū)域，為β基因3'端非編碼區(qū)域的113號堿基A突變?yōu)镚，為致病性突變，臨床表型為β+［25］。本次檢測發(fā)現(xiàn)該突變攜帶者血常規(guī)紅細胞相關參數(shù)基本正常的，僅Hb電泳發(fā)現(xiàn)HbA2略高于正常（3.8%），無明顯的臨床癥狀，與陳揚等［25］研究推測HBB：c.*113A＞G雜合突變致病類型為靜止型是相符的。本次檢出1例Vietnamese HPFH，它是一種與HPFH表型相關的30 kb珠蛋白基因簇缺失，越南GγAγ HPFH缺失在δ-珠蛋白基因下游有一個獨特的5’斷點3.5 kb，3'斷裂點位于HPFH-3斷裂點上游約8 kb處，位于HPFH-4的3'斷點區(qū)域內(nèi)［18］。進一步的證據(jù)表明，3'斷點區(qū)域包含功能上重要的序列，這些序列與γ-珠蛋白基因并列是胎兒血紅蛋白水平升高的一個重要因素［26］。

地貧重在預防和控制，本研究主要是收集閩南地區(qū)部分可疑地貧但常規(guī)試劑盒檢測不出的樣本，應用GAP-PCR和電泳、基因測序進行分析，檢出了幾種罕見的地貧基因突變，并介紹了這些罕見地貧基因的基本情況，豐富了閩南地區(qū)地貧相關基因突變譜，為今后閩南地區(qū)可疑地貧患者的診斷提供檢測思路，不能局限于常規(guī)試劑盒的檢測，對于可疑樣本應采用更全面的方法進行檢測，以防漏診。本研究遺憾之處是未對各罕見地貧攜帶者進行家族人群進行地貧檢測確認，對攜帶罕見地貧基因的人群進行家族可疑人群地貧檢測追蹤，有望挖掘出更多罕見類型地貧，這也是我們今后工作需要加強的地方。罕見地貧基因型雖在人群中占比不高，但依然不能忽視針對罕見地貧突變的研究，相信未來隨著檢測技術的發(fā)展，更多的突變類型將不斷被發(fā)現(xiàn)，而某些罕見類型也將成為不罕見。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突