基于JAK1/STAT3信號(hào)通路研究高車前素對(duì)肝纖維化小鼠的影響

徐 沖，秦小東，任 麗，羅先欽*

基于JAK1/STAT3信號(hào)通路研究高車前素對(duì)肝纖維化小鼠的影響

徐 沖1，秦小東1，任 麗2，羅先欽2*

1. 重慶市中醫(yī)院 藥劑科，重慶 400021 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016

基于Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路研究高車前素對(duì)四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）小鼠的影響。小鼠連續(xù)6周背部sc CCl4溶液制備HF模型，將HF小鼠隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿（2 mg/kg）組和高車前素高、低劑量（30、10 mg/kg）組，各給藥組連續(xù)4周ip相應(yīng)藥物，末次給藥后24 h制備血清，計(jì)算肝臟指數(shù)；采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平；測(cè)定血清和肝組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）水平；測(cè)定肝組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、III型前膠原（type III procollagen，PIIINP）、IV型膠原（type IV collagen，Col-IV）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理改變；采用qRT-PCR法檢測(cè)肝組織中尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，）和纖溶酶原激活物抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1，）mRNA表達(dá)；采用Western blotting檢測(cè)肝組織中JAK1/STAT3信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)。與模型組比較，高車前素組小鼠體質(zhì)量顯著增加（＜0.05、0.01），肝臟指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01）；血清中ALT、AST活性和TBIL水平顯著降低（＜0.05、0.01）；血清和肝組織中Hyp水平顯著降低（＜0.05、0.01）；肝組織中MDA水平顯著降低（＜0.01），SOD活性顯著升高（＜0.05、0.01）；血清中LN、HA、PIIINP、Col-IV、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；光鏡下可見肝組織細(xì)胞水腫、空泡樣改變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕；肝組織中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；肝組織中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.001）。高車前素可減輕HF小鼠的肝損傷和炎癥程度，其抗HF的作用機(jī)制可能與激活uPA纖溶酶系統(tǒng)和干預(yù)JAK1/ STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

高車前素；肝纖維化；Janus激酶1/轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路；尿激酶型纖溶酶原激活物；纖溶酶原激活物抑制因子-1

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種病因?qū)е赂渭?xì)胞發(fā)生變性、炎癥及壞死等，進(jìn)而刺激肝細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）合成與降解失調(diào)，造成肝臟內(nèi)的纖維結(jié)締組織異常增生、沉積而引起的一系列病理、生理過程[1]。其本質(zhì)是由于肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）活化及ECM合成與降解不平衡，導(dǎo)致ECM過度沉積；主要表現(xiàn)為廣泛的肝細(xì)胞壞死、ECM過度沉積引起的正常肝組織破壞、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成，最終導(dǎo)致門脈高壓相關(guān)性疾病、低蛋白血癥等多種嚴(yán)重并發(fā)癥的產(chǎn)生[2]。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)HF的發(fā)病機(jī)制研究頗深，但目前大多數(shù)抗HF藥物的臨床效果不顯著，且具有藥物毒性，其實(shí)際應(yīng)用受到限制。因此，開發(fā)有效的藥物逆轉(zhuǎn)HF進(jìn)程，是治療慢性肝病，預(yù)防肝硬化、肝癌的關(guān)鍵。

龍血竭是百合科植物龍血樹屬植物劍葉龍血樹(Lour.) S. C. Chen的含脂木材經(jīng)乙醇提取而得到的樹脂，被譽(yù)為“活血圣藥”，有散瘀生新、活血止痛、止血生肌等功效，在治療冠心病、腦梗死、心肌缺血以及抗炎、創(chuàng)傷愈合等方面具有顯著的療效[3]。研究表明，龍血竭具有抗血栓、抗血小板聚集、抗纖維化等作用[4]。本課題組前期通過生物信息學(xué)方法，篩選出龍血竭中抗纖溶酶原激活物抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的活性成分高車前素，其生物活性強(qiáng)于龍血素B[5]。高車前素是一種黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗增殖、抗真菌、抗癲癇、抗誘變、抗腫瘤、保肝、抑制血管生成等多種藥理活性[6]。高車前素可能通過Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，抑制磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）和Twistl蛋白表達(dá)，從而抑制抗凋亡的B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bc1-2）蛋白表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖[7]。JAK1/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，JAK1/STAT3信號(hào)通路與HF有著極其密切的聯(lián)系，但其具體的作用機(jī)制尚不明確[8-10]。因此，本研究采用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)建立HF小鼠模型，初步考察高車前素對(duì)小鼠肝功能指標(biāo)、纖維化相關(guān)指標(biāo)和肝臟病理學(xué)改變等的影響，探討高車前素對(duì)HF小鼠JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響，為其臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（渝）2018-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC第二動(dòng)物房，每籠飼養(yǎng)不多于5只，自由進(jìn)食飲水，室溫22.0～23.1 ℃，相對(duì)濕度52%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2022072）。

1.2 藥品與試劑

高車前素（批號(hào)DSTDG002601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.23%）購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司；秋水仙堿片（0.5 mg/片，批號(hào)20200802）購(gòu)自滇紅藥業(yè)集團(tuán)玉溪生物制藥有限公司；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)AUZ2122）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)AUZ2119）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）試劑盒（批號(hào)AUZ2130）均購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20210906）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)20210927）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號(hào)20211009）、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）試劑盒（批號(hào)20211124）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）試劑盒（批號(hào)20210918）、層黏連蛋白（laminin，LN）試劑盒（批號(hào)2021091）、III型前膠原（type III procollagen，PIIINP）試劑盒（批號(hào)20210909）、IV型膠原（type IV collagen，Col-IV）試劑盒（批號(hào)20211101）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)E20210301A）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號(hào)E20210312A）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)E20210407A），購(gòu)自上海繼錦化學(xué)科技有限公司；、尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，）引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RNA simple Total RNA試劑盒（批號(hào)W0103）購(gòu)自天根生化科技有限公司；RT Master Mix for qPCR（批號(hào)99152）、SYBR Green qPCR Master Mix（批號(hào)115209）購(gòu)自MCE公司；全蛋白提取試劑盒（批號(hào)20211210）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒增強(qiáng)型（批號(hào)P0010）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號(hào)P0012）、一抗稀釋液（批號(hào)P0023）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號(hào)ab169795）、JAK1抗體（批號(hào)ab126315）、p-JAK1抗體（批號(hào)ab126413）、STAT3抗體（批號(hào)ab163709）、p-STAT3抗體（批號(hào)ab163518）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)BST17C18B17D54）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（批號(hào)BST17C08A17C50）購(gòu)自博士德生物工程有限公司；發(fā)光液（批號(hào)2104602）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Western blotting Marker（批號(hào)01081673）購(gòu)自PageRuler公司；CCl4（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、二甲苯、中性樹膠等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

CLW-1020型純水機(jī)（重慶乾崍儀器有限公司）；Allegra X-12型離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；Mias-2000型病理圖象處理系統(tǒng)（四川大學(xué)圖象處理國(guó)家研究所）；AU480型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；756PC型紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ST360型酶標(biāo)儀（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；Mastercycler?nexus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠公司）；ChemiDoc XRS＋型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

參照文獻(xiàn)方法[11-14]，取65只雄性昆明種小鼠，背部sc現(xiàn)用現(xiàn)配的40% CCl4橄欖油溶液（10 mL/kg），2次/周，連續(xù)6周，制備HF小鼠模型，另取15只小鼠作為對(duì)照組。分別取5只模型小鼠和5只對(duì)照小鼠，檢測(cè)血清中肝損傷指標(biāo)（AST、ALT）活性，并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察，確定模型復(fù)制成功。造模過程中動(dòng)物死亡20只，將剩余40只HF小鼠隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿（2 mg/kg）組和高車前素高、低劑量（30、10 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ip相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ip等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，稱定體質(zhì)量，摘眼球取血，取肝臟組織，用PBS緩沖液沖洗3次，稱定肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)[15-16]。

肝臟指數(shù)＝肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量

2.2 各組小鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

各組小鼠摘眼球取血后，離心分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中ALT、AST活性及TBIL水平。

2.3 各組小鼠血清中HF相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取各組小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平。

2.4 各組小鼠肝組織中SOD活性及MDA、GSH水平測(cè)定

取各組小鼠肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗去浮血，用生理鹽水研磨成10%的肝組織勻漿，4 ℃、3500 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒說明書測(cè)定SOD活性及MDA、GSH水平。

2.5 各組小鼠血清和肝組織中Hyp水平測(cè)定

按試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠血清和肝組織中Hyp水平。

2.6 各組小鼠肝組織中炎癥因子水平測(cè)定

按ELISA試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.7 各組小鼠肝組織病理觀察

取各組小鼠肝大葉相同部位的小塊肝組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟常規(guī)包埋后切片（4～5 μm厚），進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，自然晾干后中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

2.8 各組小鼠肝組織中uPA和PAI-1 mRNA表達(dá)

取各組小鼠肝組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析[17-18]。引物序列為上游引物5’-AAAACAGTAATCCC- TACGAA-3’，下游引物5’-TTTAATGAGGAGTACT- GGAC-3’；上游引物5’-TGTCCCTTCTACA- GGG-3’，下游引物5’-GGGTTACAGCACTTGGA- CG-3’；上游引物5’-TTGTGAGACCCAATC- CG-3’，下游引物5’-AGATTTCTGAGCCGCAAG-3’。

2.9 各組小鼠肝組織中JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組小鼠肝組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上充分裂解，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗滌5 min，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉1 h；分別加入p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌10 min，洗滌3次，加入二抗（1∶10 000），室溫封閉2 h；TBST洗滌10 min，洗滌3次，加入ECL發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值[8-10]。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 高車前素對(duì)HF小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降（＜0.01），肝臟指數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（＜0.05、0.01），肝臟指數(shù)明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.2 高車前素對(duì)HF小鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST活性和TBIL水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST活性和TBIL水平均顯著降低（＜0.05、0.01），提示高車前素對(duì)HF小鼠肝損傷有一定保護(hù)作用。

表1 高車前素對(duì)HF小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響(, n = 10)

Table 1 Effect of hispidulin on body weight and liver index in HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)體質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/% 對(duì)照—38.8±5.94.81±0.92 模型—27.5±6.4##6.44±0.94## 秋水仙堿234.7±5.2**5.11±0.88** 高車前素3035.6±4.8**5.25±0.79** 1034.3±6.2*5.60±0.84*

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表2 高車前素對(duì)HF小鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響(, n = 10)

Table 2 Effect of hispidulin on liver function indicators in serum of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)ALT/(U·L?1)AST/(U·L?1)TBIL/(μmol·L?1) 對(duì)照—60.52±15.18123.65±31.10302.7±82.8 模型—278.64±50.36##347.43±67.34##532.9±91.1## 秋水仙堿2207.30±42.44**273.21±56.29**387.0±80.8** 高車前素30209.67±56.37**265.67±45.79**396.9±82.3** 10225.54±58.32*287.08±52.23**430.8±90.3**

3.3 高車前素對(duì)HF小鼠血清中HF相關(guān)指標(biāo)的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中LN、HA、PIIINP和Col-IV水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中LN、HA、PIIINP和Col-IV水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中MDA水平明顯升高（＜0.01），SOD活性和GSH水平明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中MDA水平明顯降低（＜0.01），SOD活性明顯升高（＜0.05、0.01），GSH水平呈升高趨勢(shì)。

3.5 高車前素對(duì)HF小鼠血清和肝組織中Hyp水平的影響

如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清和肝組織中Hyp水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清和肝組織中Hyp水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.6 高車前素對(duì)HF小鼠血清中炎癥因子水平的影響

如表6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01），提示高車前素可通過抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗HF的作用。

表3 高車前素對(duì)HF小鼠血清中HF相關(guān)指標(biāo)的影響(, n = 10)

Table 3 Effect of hispidulin on HF related indicators in serum of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)LN/(ng·mL?1)HA/(ng·mL?1)PIIINP/(ng·mL?1)Col-IV/(ng·mL?1) 對(duì)照—98.34±24.0847.32±12.5717.35±7.5626.09±8.35 模型—319.67±70.24##135.39±36.86##53.83±12.75##72.04±20.64## 秋水仙堿2221.98±65.31**77.91±29.17**38.32±10.16**45.16±19.36** 高車前素30210.14±69.55**83.41±36.65**36.51±13.60**49.58±18.47* 10237.36±60.16**80.27±30.10**40.63±14.29*52.28±16.86*

表4 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響(, n = 10)

Table 4 Effect of hispidulin on antioxidant related indicators in liver tissue of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)MDA/(nmol·mg?1)SOD/(U·mL?1)GSH/(U·mL?1) 對(duì)照—4.38±0.36103.31±35.3480.21±10.37 模型—6.23±0.57##68.76±21.09##59.34±21.69## 秋水仙堿25.10±0.49**97.34±24.57**72.39±23.58 高車前素305.24±0.54**90.45±27.31*74.61±30.12 105.40±0.63**96.37±26.60**69.43±22.86

表5 高車前素對(duì)HF小鼠血清和肝組織中Hyp水平的影響(, n = 10)

Table 5 Effect of hispidulin on Hyp levels in serum and liver tissue of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)血清Hyp/(μg·mL?1)肝組織Hyp/(μg·mg?1) 對(duì)照—61.37±3.48135.59±44.17 模型—72.64±5.41##237.32±53.64## 秋水仙堿266.59±3.26**171.65±50.35** 高車前素3065.23±2.34**174.54±46.31** 1066.27±4.03*182.63±57.83*

3.7 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織中uPA和PAI-1 mRNA表達(dá)的影響

如表7所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，高車前素高、低劑量組小鼠肝組織中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），秋水仙堿組小鼠肝組織中和mRNA表達(dá)均無(wú)顯著差異。

表6 高車前素對(duì)HF小鼠血清中炎癥因子水平的影響(, n = 10)

Table 6 Effect of hispidulin on inflammatory factors levels in serum of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-1β/(pg·mL?1)IL-6/(pg·mL?1) 對(duì)照—181.32±35.78307.92±81.06137.53±25.65 模型—318.87±76.70##575.65±90.32##271.32±53.16## 秋水仙堿2248.54±63.09**402.56±101.36**183.17±40.58** 高車前素30236.42±59.50**431.87±84.54**188.80±51.65** 10249.51±70.72*470.34±93.09**201.30±46.24**

表7 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織中uPA和PAI-1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 10)

Table 7 Effect of hispidulin on uPA and PAI-1 mRNA expressions in liver tissue of HF mice (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)mRNA相對(duì)表達(dá)量 uPAPAI-1 對(duì)照—1.000±0.0511.000±0.093 模型—0.437±0.042##1.528±0.103## 秋水仙堿20.525±0.0631.427±0.219 高車前素300.863±0.048**1.248±0.157** 100.717±0.053**1.280±0.204**

3.8 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝索呈放射狀，肝小葉和匯管區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生；模型組小鼠肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、不規(guī)則，出現(xiàn)明顯水腫，肝細(xì)胞體積變大，呈空泡樣變性，可見肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和明顯纖維間隔形成；與模型組比較，各給藥組肝細(xì)胞排列趨于正常，細(xì)胞水腫、空泡樣改變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，提示高車前素對(duì)CCl4致HF小鼠肝組織損傷具有明顯的保護(hù)作用。

圖1 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織病理變化的影響 (HE, ×200)

3.9 高車前素對(duì)HF小鼠肝組織中JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，高車前素低劑量組小鼠肝組織中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001），提示高車前素抗HF的作用機(jī)制可能與下調(diào)JAK1/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

4 討論

近年來，HF的發(fā)病率越來越高，已成為目前備受關(guān)注的社會(huì)健康問題，亟待利用我國(guó)中醫(yī)藥資源的優(yōu)勢(shì)，加強(qiáng)中藥抗HF機(jī)制研究。CCl4可通過直接破壞肝細(xì)胞膜，造成肝細(xì)胞損傷壞死，長(zhǎng)期給藥可導(dǎo)致HF、肝硬化和肝癌，其病理組織學(xué)變化與人類HF相似，現(xiàn)已被廣泛用于抗HF藥物的研究。

與對(duì)照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：***P＜0.001

本研究采用sc CCl4建立HF小鼠模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST活性及TBIL水平以及血清和肝組織中Hyp水平均顯著升高，肝組織MDA水平顯著升高，肝組織SOD活性和GSH水平明顯降低，同時(shí)血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，這些細(xì)胞因子的不斷刺激又可進(jìn)一步加重肝損傷，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致HF的發(fā)生發(fā)展。高車前素能夠顯著降低血清中ALT、AST活性和TBIL水平，下調(diào)血清和肝組織中Hyp水平，降低血清中MDA水平并升高SOD活性，且對(duì)GSH水平有上調(diào)趨勢(shì)；此外，高車前素能夠降低肝臟指數(shù)和血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，使肝細(xì)胞排列趨于正常，細(xì)胞水腫、空泡樣改變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。提示高車前素可有效減輕CCl4誘導(dǎo)HF模型小鼠的肝損傷和炎癥程度，具有明顯的保肝作用。

PAI-1作為一種單鏈糖蛋白，由379個(gè)氨基酸殘基組成，屬于絲氨酸蛋白酶家族，通過與纖溶酶原激活物絲氨酸活性中心結(jié)合，使其活化作用喪失。PAI-1是專一抑制纖溶酶原激活的抑制劑，在生理?xiàng)l件下，PAI-1通過形成復(fù)合物來抑制uPA和組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA），從而阻止纖溶酶的形成。PAI-1在肝臟中主要由巨噬細(xì)胞、肝竇細(xì)胞和HSC表達(dá)。在正常肝臟中PAI-1含量很低，肝部分切除后再生細(xì)胞中的PAI-1含量升高。研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1與HF的發(fā)生關(guān)系密切，隨著纖維化的加重，PAI-1含量增加，抑制PAI-1表達(dá)可以有效抑制HSC活性。PAI-1可阻止uPA激活纖溶酶原，降低基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性，導(dǎo)致ECM在肝細(xì)胞內(nèi)過多沉積，PAI-1還可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化為活化的成纖維細(xì)胞[19]。在PAI-1過表達(dá)小鼠中纖維蛋白沉積和器官纖維化增加[20]，而PAI-1缺陷小鼠中HF減弱[21]。CCl4誘導(dǎo)的HF小鼠模型中，PAI-1在HF進(jìn)程中持續(xù)上調(diào)，可能參與Col-I、Col-III的表達(dá)調(diào)控，在HF的發(fā)生中起重要作用，從而證實(shí)了PAI-1可促進(jìn)HF時(shí)基質(zhì)蛋白的合成[22]。臨床實(shí)踐表明，HA、LN、PIIINP和Col-IV 4項(xiàng)指標(biāo)是臨床判斷HF的重要血清學(xué)指標(biāo)，其水平與肝組織炎癥活動(dòng)及纖維化均呈正相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平顯著升高，同時(shí)小鼠肝組織中mRNA表達(dá)水平顯著降低，而mRNA表達(dá)水平顯著升高，說明CCl4引起了小鼠肝組織的損傷及纖維化；給予高車前素干預(yù)后，小鼠血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平均顯著下降，肝組織中mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明高車前素具有抗HF作用，其作用機(jī)制可能與激活uPA纖溶酶系統(tǒng)有關(guān)。

JAK/STAT信號(hào)通路是一條由細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的信號(hào)通路，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及免疫調(diào)控等生物學(xué)過程，主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT組成。血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、IL-4、IL-6、瘦素、生長(zhǎng)激素和γ干擾素等細(xì)胞因子均能激活這一通路，其中最主要刺激因子為PDGF，當(dāng)PDGF與受體結(jié)合后，會(huì)磷酸化JAK1，繼而磷酸化STAT3，之后與受體分離進(jìn)入核內(nèi)，激活靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，直接促進(jìn)HSCs生長(zhǎng)和分裂，提示JAK1/STAT3信號(hào)通路在HF的形成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活可延緩HF的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，高車前素低劑量組小鼠肝組織中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，表明高車前素抗HF的作用機(jī)制可能調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子有關(guān)。

綜上所述，高車前素可有效減輕CCl4誘導(dǎo)HF小鼠的肝損傷和炎癥程度，其抗HF的作用機(jī)制可能與激活uPA纖溶酶系統(tǒng)和干預(yù)JAK1/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of hispidulin on hepatic fibrosis mice based on JAK1/STAT3 signaling pathway

XU Chong1, QIN Xiao-dong1, REN Li2, LUO Xian-qin2

1. Department of Pharmacy, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400021, China 2. College of Traditional Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

To study the effect of hispidulin on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatic fibrosis (HF) mice based on Janus kinase 1 (JAK1) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling pathway.HF model was prepared by sc CCl4solution on the back of mice for six consecutive weeks, HF mice were randomly divided into model group, colchicine (2 mg/kg) group and hispidulin high-and low-dose (30, 10 mg/kg) groups, each administration group was ip corresponding drug for four consecutive weeks, serum was prepared at 24 h after the last administration, and liver index was calculated; Fully automated biochemical analyzer was used to measure alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities and total bilirubin (TBIL) level in serum; Levels of hydroxyproline (Hyp) in serum and liver tissues were detected; Malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels and superoxide dismutase (SOD) activity in liver tissues were detected; Hyaluronic acid (HA), laminin (LN), type III procollagen (PIIINP), type IV collagen (Col-IV), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 levels in serum were detected; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe pathological changes in liver tissues; qRT-PCR was used to detect urokinase type plasminogen activator () and plasminogen activator inhibitor-1 () mRNA expressions in liver tissues; Western blotting was used to detect the expressions of related proteins in JAK1/STAT3 signaling pathway in liver tissues.Compared with model group, body weight of mice in hispidulin group was significantly increased (< 0.05, 0.01), liver index was significantly decreased (< 0.05, 0.01), ALT, AST activities and TBIL level in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01), Hyp levels in serum and liver tissue were significantly decreased (< 0.05, 0.01), MDA level in liver tissue was significantly decreased (< 0.01), while SOD activity was significantly increased (< 0.05, 0.01), levels of LN, HA, PIIINP, Col-IV, TNF-α, IL-1β and IL-6 in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Hepatic tissue edema, vacuolar-like changes, and inflammatory cell infiltration were observed under light microscope;mRNA expression in liver tissue was significantly increased (< 0.01), andmRNA expression was significantly decreased (< 0.01); p-JAK1 and p-STAT3 protein expression levels in liver tissue were significantly decreased (< 0.001).Hispidulin can reduce liver injury and inflammation in HF mice, and its anti-HF mechanism may be related to the activation of uPA plasmin system and intervention of JAK1/STAT3 signal transduction pathway.

hispidulin; hepatic fibrosis; Janus kinase 1/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway; urokinase type plasminogen activator; plasminogen activator inhibitor-1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6093 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.015

2022-06-16

重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（cstc2019jcyj-msxmX0044）

徐 沖，副主任中藥師，從事中藥有效成分和藥理活性研究。Tel: (023)67063730 E-mail: chongxu@cdutcm.edu.cn

羅先欽，研究員，從事中藥藥理與毒理評(píng)價(jià)研究。Tel: (023)65712062 E-mail: lxq_0203@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]