轉錄因子調控青蒿素生物合成的作用機制研究進展

詹忠根

轉錄因子調控青蒿素生物合成的作用機制研究進展

詹忠根

浙江經貿職業技術學院生物制藥教研室，浙江 杭州 310018

青蒿素是從藥用植物黃花蒿中分離的一種倍半萜內酯，廣泛應用于瘧疾治療，野生資源含量較低。為緩解持續增加的需求，嘗試提高青蒿素含量或產量的研究成為熱點課題。轉錄因子具有調節代謝途徑中一個或多個基因表達的作用，據報道，已有多個轉錄因子家族參與調節青蒿素的生物合成和積累，干預轉錄因子表達是提高青蒿素含量或產量的重要手段。從轉錄因子調控黃花蒿腺毛形成與發育和轉錄因子調控青蒿素生物合成2個方面綜述青蒿素的生物合成機制，以期為青蒿素代謝的轉錄調控研究提供參考。

青蒿素；轉錄因子；生物合成；腺毛發育；激素信號；光信號；逆境脅迫

青蒿素是從藥用植物黃花蒿L.中分離的一種含有“過氧橋”結構（1,2,4-三烷環）的倍半萜內酯（圖1），廣泛應用于瘧疾治療。全球每年新增瘧疾病例連續多年超過2億，加之青蒿素及其衍生物還具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗氧化及治療糖尿病、肺結核等潛力，致使其國際需求持續增加[1-2]。但青蒿素僅分布于黃花蒿葉片、芽和花表面的分泌性腺毛（glandular secretory trichomes，GSTs），野生資源含量較低（占植物干質量的0.1%～1.0%）且不穩定[3]。為緩解日益突出的供需矛盾，近年來嘗試了多種方法試圖提高青蒿素的含量或產量，如成功培育青蒿素含量超過2%（干質量）的高產品種[4]，利用酵母工程菌半合成青蒿素初步達到可商業化的工藝水平[5]，抑制競爭代謝途徑關鍵酶（鯊烯合成酶）基因獲得青蒿素質量分數為31.4 mg/g的高產轉基因植株[6]，過表達青蒿素生物合成關鍵酶基因或轉錄因子基因使青蒿素含量成倍增加[7-8]，以及利用異源宿主[9]或黃花蒿自交系非GSTs細胞合成青蒿素[10]等研究為提高青蒿素產量做出了有益探索。

圖1 青蒿素的化學結構

盡管上述研究未能從根本上解決青蒿素供應不足或有效降低青蒿素生產成本的難題，卻為人們深入了解青蒿素生物合成及其調控機制提供了很好的幫助。目前，青蒿素生物合成途徑已基本明確[11]，黃花蒿基因組測序也已完成[12]，但要進一步提高青蒿素生物合成能力仍缺乏良好的遺傳轉化體系，通過串聯表達等技術靶向生產青蒿素將同時面臨鑒定大量結構基因和轉化效率低等困難。青蒿素生物合成基因的時空表達受不同轉錄因子的嚴格調控，隨著青蒿素生物合成過程的基本闡明，科學工作者更加注重青蒿素生物合成相關的轉錄因子研究并取得長足進展。因此，本文從轉錄因子調控黃花蒿腺毛形成與發育和轉錄因子調控青蒿素生物合成2個方面綜述其調控青蒿素生物合成的作用機制，以期為青蒿素代謝的轉錄調控研究提供參考。

1 黃花蒿轉錄因子研究概況

由于基因擴張，黃花蒿中的轉錄因子數量眾多，基因組中發現2717個，尤其是香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、遠紅色受損應答1（far-red impaired response 1，FAR1）和根瘤起始類蛋白（nodule inception-like protein，NLP）3個轉錄因子家族數量遠超其他物種[12]，轉錄組中檢測到55個家族的1588個轉錄因子，其中乙烯響應因子（ethylene resposive factor，ERF）家族成員最多，達123個，且堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子（basic helix-loop-helix transcription factors，bHLH）、C2H2鋅指結構轉錄因子（Cys2/His2-type zinc finger protein，C2H2）、NAC轉錄因子（NAM-ATAF1/2-CUC2，NAC）、C3H、WRKYGQK結構域鋅指型轉錄因子（WRKYGQK domain zincfinger motif，WRKY）、MYB轉錄因子、堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子（basic leucine zipper，bZIP）和GRAS轉錄因子家族成員也超60個[13]。由于轉錄因子能有效調節植物次生代謝的生物合成，為厘清青蒿素生物合成轉錄調控網絡，近年來基于基因組數據[12]、轉錄組測序[13]、文庫篩選[14]相繼發現AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC、WRKY和bZIP等多個轉錄因子家族成員參與青蒿素的生物合成調控。如Shen等[12]應用熱力圖從黃花蒿全基因組數據中鑒定了15個調控青蒿素生物合成的轉錄因子，Hao等[13]發現ERF、MYB、bHLH、HD-ZIP、賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶（lysine specific demethylase，LSD）和E2F/DP家族成員介導光照下茉莉酸（jasmonate，JA）處理的青蒿素生物合成，Pan等[15]用基因芯片檢測到WRKY家族成員AaWRKY11、AaWRKY14參與UV-B輻照處理后的青蒿素生物合成，在光與赤霉素（gibberellins，GA）協同提升青蒿素生物合成的研究中發現、、、、等179個轉錄因子基因與紫穗槐二烯合成酶（amorpha-4,11-diene synthase，）基因共表達，、、、等161轉錄因子基因與細胞色素P450依賴性羥化酶基因（cytochrome P450 monooxygenase，）共表達[16]。此外，還對AaMYB1[17]等近40個轉錄因子的調控功能進行了較為詳盡的研究（表1），為揭示轉錄因子調控青蒿素生物合成機制及利用基因工程技術提高青蒿素含量打下了堅實的研究基礎。

表1 青蒿素生物合成相關轉錄因子

Table 1 Transcription factors of artemisinin biosynthesis

類型轉錄因子名稱功能文獻 MYBAaMYB1可激活腺毛形成必需基因GL1、GL2表達及GA4合成與降解，共同促進GSTs形成，促進CYP71AV1、ADS基因表達17 AaMYB2AaMYB2過表達植株中，AaHD1、AaMYB1、CYP71AV1基因表達量下降，腺毛密度降低18 AaMYB4響應UVB輻照，正調控ADS、DBR2基因表達19 AaMYB5/AaMYB16AaMYB5響應JA刺激，抑制腺毛形成，形成AaHD1-AaMYB5復合體調控AaGSW2轉錄因子；AaMYB16促進腺毛形成，形成AaHD1-AaMYB16復合體調控AaGSW2轉錄因子20 AaMYB15響應暗處理和JA刺激，負調控ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1和AaORA基因表達21 AaMYB17正調控GSTs形成22 AaMIXTA1通過促進角質層、蠟質形成，進而正調控腺毛發育23

續表1

HD1-同源結構域蛋白1 GSW2- GST-特異性WRKY轉錄因子 TLR1/TLR2-腺毛負調節因子1/2 TAR2-腺毛和青蒿素調節因子2 HY5-下胚軸伸長轉錄因子 TGA-TGACG基序結合因子 PIFs-光敏色素互作因子 MYC2-骨髓細胞組織增生因子2 EIN3/EIL-乙烯不敏感因子3/乙烯不敏感樣因子3 MeJA-茉莉酸甲酯 ABA-脫落酸 SA-水楊酸

HD1-homeodomain protein 1 GSW2- GST-specific WRKY transcription factor TLR1/TLR2-trichomeless regulator 1/2 TAR2-trichome and artemisinin regulator 2 HY5-elongated hypocotyl 5 TGA-TGACG motif-binding factor PIFs-phytochrome interacting factors MYC2-myelocytomatosis 2 EIN3/EIL-ethylene-insensitive 3/EIN3-like MeJA-methyl jasmonate ABA-abscisic acid SA-salicylic acid

2 轉錄因子調控黃花蒿腺毛形成與發育

黃花蒿葉片、芽和花表面存在2種多細胞頭狀腺毛，即GSTs和T型非分泌性腺毛（T-shaped non-glandular trichomes，TNGs）。GSTs由10個細胞（2個基細胞、2個頸細胞、4個近頂細胞和2個頂細胞）及1個儲存青蒿素的皮下空間組成，是青蒿素生物合成的主要場所，ADS、CYP71AV1、青蒿素醛Δ11(13)還原酶2（double bond reductase 2，DBR2）和醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）等青蒿素生物合成關鍵酶及大量轉錄因子基因在GSTs的頂細胞和近頂細胞中表達[14,53]。因此，GSTs數量越多（或密度越高），生物合成能力越強，意味著青蒿素含量越高。然而，GSTs僅占植株干質量的2%且易于脫落，以及在GSTs中合成的其他萜類與青蒿素合成存在代謝競爭等因素極大阻礙了青蒿素產量的提升，通過轉錄因子促進GSTs形成、改善GSTs生長發育狀態是提升藥材整體品質的有效策略[10,54]。

研究表明，R2R3-MYB和HD-ZIP IV類轉錄因子在GSTs的形成與發育中扮演重要角色（圖2）。AaMYB1是第1個從黃花蒿腺毛特異性EST文庫中分離的腺毛形成相關轉錄因子，位于R2R3-MYB亞家族S13亞組，編碼330 aa，在黃花蒿葉片成熟時表達上調并持續到花蕾形成。過表達可激活腺毛形成必需基因表達及GA4合成與降解，共同促進GSTs形成[17]。AaMYB2能與擬南芥腺毛調控復合體蛋白GL3直接作用，過表達的植株中、、基因表達量下降，腺毛密度降低。主要在GSTs基細胞中表達的R2R3-MYB S9亞組轉錄因子AaMIXTA1促進黃花蒿GSTs和TNGs密度增加可能與其正調控角質層、蠟質形成有關。過表達AaMIXTA1、RNA干擾和雙熒光素酶報告基因檢測均顯示AaMIXTA1正調控角質層形成基因、和蠟質形成基因、、表達[23]。而與AaMIXTA1同源的轉錄因子AaMYB17，主要在芽尖等分生組織的GSTs特異表達，其正調控GSTs形成的作用機制與AaMIXTA1有所差異，并非通過調控角質層生物合成基因表達發揮作用[22]。研究發現，另一R2R3-MYB轉錄因子AaTLR1在AaWOX1介導下與LFY轉錄因子AaTLR2結合，通過抑制GA合成，下調腺毛形成正調控轉錄因子、和基因表達等負調控GSTs形成，并下調、、、基因表達進一步抑制青蒿素生物合成[24]。

除R2R3-MYB外，2種HD-ZIP IV轉錄因子AaHD1、AaHD8調控腺毛形成的機制研究較為詳盡，兩者既可單獨發揮作用，也可通過相互作用增強活性或共同調控其他轉錄因子活性，促進腺毛形成。在外源JA刺激下，AaHD1與抑制蛋白AaJAZ8分離，釋放出的AaHD1促進GSTs和TNGs形成，敲除基因，JA促進腺毛形成的作用下降[26]，而AaHD8可通過激活角質層生物合成關鍵酶基因表達間接促進腺毛形成[25]。同時，位于上游的AaHD8可與AaHD1啟動子L1-box（TAAATGC/TA）結合，增強AaHD1的調控活性或與AaMIXTA1形成復合體，協同增強對角質層形成及AaHD1的調控效果[27]，此外，AaHD1、AaHD8還可分別調控AaGSW2、AaTAR2轉錄因子的活性，促進GSTs形成[25,33]。而2個調控作用相反且相互競爭的轉錄因子AaMYB5、AaMYB16則很大程度依賴與AaHD1的START-SAD結構域結合，才能發揮對AaGSW2轉錄因子的調控作用[20]。由于HD-ZIP轉錄因子通常以二聚體形式發揮調控作用，深入研究AaHD1/AaHD8的相互作用機制有助于揭示調控腺毛形成的特異性調節因子。

圖2 轉錄因子通過調控GSTs形成與發育對青蒿素產量的影響

與前述轉錄因子調控功能不同，AP2/ERF轉錄因子AaTAR1和S15亞組的MYB轉錄因子AaTAR2調控的是腺毛發育過程而不是腺毛形成。在TAR1-RNAi植株中，GSTs頂部細胞膨脹、GSTs細胞數量減少、表皮蠟質異常沉積和角質層滲透性發生改變[34]。抑制基因表達，GSTs和TNGs 2種腺毛形態發生劇烈變化，腺毛細胞皺縮，缺乏支持，但過表達基因對腺毛形態和密度無明顯影響[25]。此外，也有報道鋅指蛋白AaSAP1和WRKY轉錄因子AaTTG1、AaGL3能響應JA誘導，正調控腺毛的發育，提高腺毛密度，但具體機制還有待進一步解析[55-56]。

通常認為，TNGs與GSTs的主要區別是其不具有分泌和貯存各種次生代謝物的能力，但隨著TNGs青蒿素合成能力的證明[10]，以及多種轉錄因子（如AaHD1、AaHD8、AaMIXTA1、AaTAR2等）同時調控GSTs和TNGs的形成，表明2種腺毛的形成至少在早期階段可能具有相同或相似的分子機制，為進一步開發非GSTs資源合成青蒿素的研究提供了有力的理論依據。

3 轉錄因子調控青蒿素生物合成

3.1 調控青蒿素生物合成關鍵酶基因表達

以法尼基焦磷酸（famesyl diphosphate，FPP）合成為分界點，青蒿素生物合成可分為上游步驟和下游步驟2個階段（圖3）。青蒿素生物合成上游步驟已比較清楚，有較為公認的限速酶和酶促反應。其中，甲羥戊酸（mevalonate acid，MVA）途徑是FPP合成的主要貢獻者，阻斷MVA途徑青蒿素含量降低80.4%，而阻斷2-甲基赤蘚醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑青蒿素含量僅降低14.2%[57]。進一步研究表明，MEP途徑關鍵酶基因僅在含有葉綠體的GSTs近頂細胞中表達[58]。FPP合成時，由MEP途徑提供1分子異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）先與MVA途徑生成的1分子二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）合成牻牛兒基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），然后轉運至頂細胞與胞質中MVA途徑提供的1分子IPP形成通用前體FPP[59]。在下游步驟，FPP先被ADS催化生成紫穗槐二烯（amorpha-4,11-diene，AD），再經CYP71AV1催化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸[60-62]。值得注意的是，青蒿醛既可在DBR2、ALDH1催化下形成二氫青蒿醛、二氫青蒿酸，并最終生成青蒿素[63-64]，也可被ALDH1、CYP71AV1催化生成青蒿酸而最終形成青蒿素B[62,65]。可見，DBR2酶的活性對于青蒿醛是否被DBR2有效催化形成二氫青蒿醛至關重要，是能否得到高含量青蒿素的關鍵。另外，青蒿醇也可形成其他中間產物參與青蒿素合成，如青蒿醇可被催化形成二氫青蒿醇[63]，再被CYP71AV1和ALDH1催化形成二氫青蒿醛［二氫青蒿醛也可被二氫青蒿醛還原酶1（dihydroartemisinic aldehyde reductase 1，RED1）還原成二氫青蒿醇］，參與青蒿素合成[66-67]。但下游步驟仍存在一些爭議之處：如有研究認為青蒿酸可經青蒿素B和青蒿烯進而形成青蒿素[68]，而前體飼喂研究表明二氫青蒿酸才是青蒿素的直接前體，青蒿酸并不能轉化為二氫青蒿酸和青蒿素，其主要代謝產物是青蒿素B[60,65]。再如，盡管有研究證明二氫青蒿酸轉化成青蒿素及青蒿酸轉化成青蒿素B的過程是一種自發的光氧化反應，而非酶促反應[69]，但也有研究認為，青蒿素含有過氧橋鍵，可能存在一種過氧化物酶或其他一系列氧化酶催化二氫青蒿酸轉化成青蒿素[70]。現已證明，過氧化物酶在黃花蒿無細胞系系統中間接參與向青蒿素的生物轉化[71]，并發現3種與青蒿素含量相關的過氧化物酶[72-74]，如果能分離出相應的酶，將極大促進青蒿素的合成生物學研究。

圖3顯示多種限速酶控制著青蒿素的合成進程，這些酶的基因表達水平受轉錄因子嚴格調控，迄今已報道AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC、WRKY、bZIP、HD-ZIP IV、TCP、SPL、YABBY等家族的眾多轉錄因子具有調控青蒿素生物合成關鍵酶基因、表達的作用。由于這些基因的啟動子區域含有多種轉錄因子結合位點，如AP2/ERF結合位點RAA基序、WRKY結合位點W-Box、bZIP結合位點ABRE基序、MYB結合位點E-Box、bHLH結合位點G-box[75]，因此，在已有研究中，大部分轉錄因子能與相應位點特異性結合，激活基因表達，直接正調控青蒿素生物合成。如最近發現AaWRKY17和AabZIP9能與ADS啟動子W-box基序、“ACGT”順式作用元件結合，上調基因表達，過表達植株中青蒿素、雙氫青蒿素和青蒿酸含量分別提高23.2%～67.1%、34.5%～92.8%、40.4%～121.2%[30,38]。AaSPL2能與啟動子的GTAC-bow基序結合，調控基因轉錄，過表達植株中青蒿素含量提高33%～86%[49]。AaYABBY5能直接與、啟動子結合，或以其他方式間接上調、基因表達，過表達植株中雙氫青蒿素和青蒿素含量顯著提高[50]。同時也有部分轉錄因子通過與其他轉錄因子相互作用而間接正調控青蒿素生物合成，如AaMYB2和bHLH類轉錄因子AaPIF3對基因表達均有促進作用，過表達AaPIF3，青蒿素含量提高55.97%～65.21%[12,42]，但AaPIF3只能通過AaERF1起間接調控作用[76]；乙烯信號關鍵因子AaEIN3通過促進葉片衰老基因表達，加速黃花蒿葉片衰老，進而減弱、、和基因表達，降低青蒿素積累[51]。還有一些轉錄因子（如AaMYB15）作為負調控因子參與青蒿素生物合成[21]。此外，AaWRKY40、AaPWA73483、AaPWA66309等多個轉錄因子的調控機制也在繼續研究之中[31]。

G3P-甘油醛-3-磷酸酯 HMGS-3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合酶 HMGR-3-羥基-3甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶 DXS-1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 DXR-1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶 IDS-異戊烯基焦磷酸異構酶 FPS-法呢基焦磷酸合酶 DBR2-雙鍵還原酶2 CPR-細胞色素P450還原酶

3.2 調控青蒿素生物合成相關的激素信號傳導

外源JA/MeJA、SA、ABA和GA等多種激素促進青蒿素生物合成離不開轉錄因子的參與，如ABA可激活AabZIP1轉錄因子上調和表達[37]。JA能激活多種轉錄因子，促進GSTs發育及激活青蒿素生物合成基因轉錄[13,77]。目前，轉錄因子參與激素信號傳導調控青蒿素生物合成的研究已獲得較大進展，部分重要調控機制逐步得到揭示。

3.2.1 調控JAs信號傳導 JAs是研究最多也是促進青蒿素生物合成最有效的植物激素，能上調青蒿素合成酶基因、、和轉錄因子表達、促進GSTs形成與發育，提高青蒿素及其衍生物含量[47,77]。JA信號介導的轉錄調控核心模型是SCFCOI1-JAZs-MYC2復合體，在JA作用下，轉錄抑制因子JAZ蛋白降解，釋放出MYC2等轉錄因子激活下游JAs應答基因表達。研究表明，轉錄因子參與JA調控青蒿素生物合成的作用包括2個方面，一是激活JA生物合成關鍵基因，如AaTCP14上調丙二烯氧化環化酶基因（allene oxide cyclase，）和12-羰-植物二烯酸還原酶3基因（12-oxo-phytodienoic acid reductase 3，）表達，促進內源性JA生物合成，進而提高青蒿素產量[47]。二是激活JAs應答因子，促進JA信號傳導，上調青蒿素生物合成基因表達。早期發現，在MeJA作用下，AP2/ERF轉錄因子（AaTAR1、AaERF1、AaERF2）、AaWRKY1、AabHLH1表達增加，分別與、啟動子GCC-box/RAA/CBF2、W-box、E-box結合，上調基因表達[28,34-35,43]。隨著AaORA[36]、AaGSW1[32]、AaMYC2[45]、AaTCP14[47]、AaTCP15[48]等轉錄因子功能的相繼確定，JA促進青蒿素生物合成的轉錄調控網絡逐漸被揭示。bHLH轉錄因子AaMYC2受AaJAZs負調控，既是響應JA信號通路的核心調節因子，也是GA信號抑制子AaDELLAs調控節點[78]，過表達AaMYC2或AaMYC2-like，可激活、啟動子G-box基序，提高基因表達水平，顯著提高青蒿素生物合成能力[45-46]。黃花蒿轉錄因子除單獨調控青蒿素生物合成基因表達外，還與其他轉錄因子形成復合體，以級聯方式提高轉錄調控效率。如GST特異性WRKY轉錄因子AaGSW1除直接上調表達外，AaMYC2、AabZIP1（響應ABA信號）可分別與AaGSW1啟動子G-box、ABRE基序結合，并通過AaORA間接上調、表達，從而在JA信號傳導上游形成AaMYC2-AaGSW1-AaORA轉錄級聯調控模式[32]。AaORA是另一個在GST特異性表達的AP2/ERF轉錄因子，上調、、及轉錄因子基因表達[36]。基于AaORA與長春花(L.) G. Don中調控萜類吲哚生物堿生物合成的關鍵轉錄因子CrORCAs[79]、煙草L.中調控尼古丁生物合成的NIC2-基因座關鍵轉錄因子ERFs高度同源[80]及JA信號下游轉錄因子CrORCA2/CrORCA3受CrMYC2調控[81]等研究結果，推測AaORA是JA信號傳導的重要調控因子，在青蒿素生物合成調控中起關鍵作用（或核心作用）。在JA信號傳導下游，AaORA轉錄因子對青蒿素生物合成基因的調控既部分依賴于AaTCP14（AaTCP14與AaORA的C端結合，形成AaTCP14-AaORA轉錄激活復合體，協同增強、轉錄活性，該復合體的形成受AaJAZ8負調控，且AaJAZ8減弱AaTCP14-AaORA對的激活作用），又能獨立行使調控作用（AaTCP14只能調控、轉錄活性，AaORA還能調控轉錄活性）[47]。與AaTCP14相似，其同源轉錄因子AaTCP15也能與AaORA的C端、N端結合，形成AaTCP15-AaORA復合體協同調控活性（與AaTCP14-AaORA不同的是AaTCP15-AaORA不能激活基因轉錄）或直接激活、轉錄，推動代謝流從青蒿醛向二氫青蒿醛方向轉化，提高青蒿素含量[48]。AaMYC2-AaGSW1-AaORA/ AaTCP14（AaTCP15）轉錄級聯調控模式的闡明為JAs調控青蒿素生物合成的動態調控機制研究提供了更好的研究平臺（圖4）。

圖4 JA信號調控青蒿素生物合成的AaMYC2-AaGSW1-AaORA/AaTCP14 (AaTCP15) 轉錄級聯模式

3.2.2 調控ABA信號傳導 ABA除調節干旱、寒冷和滲透脅迫等應激反應外，也是植物次生代謝的關鍵調節因子。在青蒿素生物合成中，外源ABA激活合成酶基因表達，提高青蒿素含量[82-83]。目前已發現多種轉錄因子參與ABA信號通路調控，其中bZIP家族A組能與ABA響應元件（ABA-responsive elements，ABRE）結合，該組中ABF1、ABF2、ABF3、ABI5等是調控ABA信號的重要轉錄因子，被稱為ABI5-ABF-AREB亞家族。研究發現黃花蒿中有145個bZIP轉錄因子，其中64個在GSTs表達，ABI5-ABF-AREB亞家族的AaABF3能激活啟動子G-box，上調基因表達[39]。AabZIP1的N末端C1結構域含有保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基，是響應ABA信號的關鍵，該結構域變異后AabZIP1無法響應ABA信號[37]。當黃花蒿體內ABA增加時，ABA先與AaPYL9受體結合啟動ABA信號傳導，隨后該復合體與2C型蛋白磷酸酶AaPP2C1結合（AaPYL9的P89S、H116A被替換以及AaPP2C1第3磷酸化位點基序的G199D被替換或缺失，則兩者相互作用即消除），從而釋放在靜息狀態下被AaPP2C1抑制的SnRK2類激酶AaAPK1[84-86]。隨著AaAPK1的激活，下游AabZIP1的Ser37位點被AaAPK1磷酸化，繼而激活AaGSW1、AaORA、AaTCP14/AaTCP15等轉錄因子活性，以AabZIP1-AaGSW1-AaTCP14（AaTCP15）/AaORA級聯方式或直接與、啟動子ABRE基序結合，上調青蒿素合成酶基因表達，提高青蒿素及其衍生物含量[32,47-48,86]。

3.2.3 調控GAs信號傳導 GAs是一種二萜類植物激素，參與種子萌發、植物開花、環境脅迫等過程。在植物體內，GAs與青蒿素共用萜類生物合成上游途徑，FPP是兩者生物合成分支點。目前，GAs中活性最強的GA3對青蒿素的調控作用仍存在一定爭議，有研究認為外源GA3可能通過刺激SA合成，觸發活性氧生成，從而促進青蒿素生物合成基因表達和/或提高青蒿素合成代謝流以增加青蒿素積累[87-89]，也有研究認為GA3并未顯著促進青蒿素生物合成或增加GSTs數量（密度），僅促進GSTs個體增大[56]。Chen等[90]研究也指出，真正有效促進青蒿素生物合成的是GA4和GA1，而不是GA3。另外，過表達GA4/GA1前體GA20/GA9生物合成關鍵酶基因，促進轉基因植物枝條數量增加，株高增長，GSTs個體增大、密度提高，青蒿素含量增長2倍[91]，該研究進一步表明GA4/GA1可能是青蒿素生物合成的主要活性GAs。在GAs信號通路中，轉錄因子同樣發揮重要作用，當植物感受到GA（GA4/GA1）信號時，R2R3-MYB、HD-ZIP IV、C2H2鋅指蛋白和bHLH轉錄因子家族隨即參與GA信號調節，AaMYB1促進和表達，提高GA9向GA4的轉化效率[17]，尤其是MYB轉錄因子AaMIXTA1表達顯著上調，并通過AaHD8正調控GSTs形成[27,90]，或與、、和啟動子的GA響應元件GARE基序結合，上調青蒿素生物合成基因表達[17]。

3.2.4 調控SA信號傳導 SA是一種調節植物生長發育、光合作用、蒸騰作用以及誘導致病基因表達、促進次生代謝產物合成的重要酚類激素。施用外源SA，可激活、等青蒿素生物合成前期基因轉錄表達，刺激細胞產生活性氧，促進二氫青蒿酸轉化為青蒿素，而對生物合成后期基因的表達影響不大[92-93]。在SA信號通路中，病程相關基因非表達子（non-expressor of pathogenesis-related genes，NPR）基因家族及bZIP類轉錄因子TGA起著關鍵作用。NPR包含ANK和BTB/POZ 2個結構域，通過ANK結構域介導，NPR的BTB/POZ結構域與TGA轉錄因子結合，發揮調控作用[94]。黃花蒿中檢測到6個TGA轉錄因子和5個基因，其中AaNPR1作為轉錄共激活因子與AaTGA6相互作用，增強AaTGA6與啟動子TGACG基序的結合能力，進而增加下游基因表達，而AaTGA3則與AaTGA6相互作用形成異二聚體，負調控AaTGA6與的結合。AaTGA6是青蒿素生物合成的重要調控因子，在過表達植株中，mRNA水平增加11～15倍，mRNA水平增加2～3倍，、、基因表達水平提高1～7倍，青蒿素含量提高90%～120%[40]。

上述研究表明，轉錄因子調控激素信號的傳導是一個相當復雜的過程，加之部分轉錄因子，如AaGSW1[32]、AabHLH1[43,95]、AaTCP15[48]等同時參與調控2種及2種以上激素信號應答，相互形成多種交叉調控，大大增加了轉錄因子調控網絡的研究難度。

3.3 調控青蒿素生物合成相關的光信號傳導

光是調節青蒿素生物合成的另一重要因子。研究顯示，過表達藍光受體AtCRY1促進和轉錄，過表達光敏色素互作因子PIF3上調、、基因表達，紅光、藍光顯著提高青蒿素及其衍生物含量，冷白光促進黃花蒿毛狀根形成及青蒿素生物合成，UVB輻照激活、、、和基因表達[96]，而暗處理使、、基因的mRNA水平下調10倍以上[13]。植物具有極其精細的光接收（如感受紅光和遠紅光的光敏色素、感受藍光/UVA的隱花色素和趨光色素、感受UVB的紫外光受體UVR8）和信號傳系統將光傳遞到光調控因子（如bZIP轉錄因子HY5、光形態建成調控因子COP1）調控相關基因表達。AaHY5有3個結構域，分別是與DNA結合的bZIP結構域、COP1位點及酪蛋白激酶II磷酸化位點。AaHY5和AaCOP1是作用相反的2個因子，在黑暗條件下，細胞核內AaCOP1聚集，負調控AaHY5生成；在光照條件下，細胞核內AaCOP1降低，AaHY5的積累啟動光形態建成，并激活表達，直接或進而激活AaORA間接正調控青蒿素生物合成（圖5）[41]。此外、、、、、等轉錄因子基因在響應光信號時表達上調，表達下調，這些轉錄因子可能也參與光信號調控[15,19]。

圖5 光與GA/JA對青蒿素生物合成的協同調控模式

JA、GA等激素調控青蒿素生物合成需要光的介導，兩者具有協同增效作用，當激素和光組合處理時，青蒿素生物合成關鍵基因、、、的表達水平顯著高于光或激素單獨處理[13,16]。研究表明，激素和光對青蒿素生物合成的協同增效作用與轉錄因子的調控作用密不可分，現已發現多種轉錄因子參與介導光與激素的協同增效過程，涉及bHLH、MYB、NAC、WRKY、ERF、LSD、HD-ZIP和E2F/DP等多個轉錄因子家族，推測的調控機制如圖5所示[13,16]。其中AaWRKY9、AaMYB15 2個轉錄因子的研究較為深入，AaWRKY9是一個由光或JA雙重誘導的腺毛特異性轉錄因子，的表達受AaHY5正調控，AaJAZ9負調控。在光下，AaHY5積累增加，AaHY5與啟動子的G-box結合后上調表達；缺乏JA時，AaJAZ9抑制表達。因此，在僅有光或JA時，促進下游基因表達的能力有限，只有在光和JA同時存在時，表達增加且AaJAZ9被降解，大量的AaWRKY9與啟動子W-box基序結合，協同提升青蒿素生物合成能力[29]。而AaMYB15是一個負調控因子，暗處理和JA處理可誘導表達，光照抑制其表達。AaMYB15能直接下調、、、等基因表達，或與啟動子結合并抑制其活性，間接下調青蒿素合成途徑關鍵酶基因表達（圖5）[21]。

在自然界，光作為一種不可或缺的環境因素與其他環境因素協同（或拮抗）調節植物次生代謝物的生物合成，其含量和產量與光質、光強、光周期密切相關[96]。盡管已對光質與青蒿素生物合成的調控關系有所了解，并對部分光響應轉錄因子進行了表征，但光強和光周期的調節機制尚少有涉及，完整的光信號通路仍不清楚，很有必要系統開展光對黃花蒿生長與發育及對青蒿素含量和產量的調控機制研究。

3.4 調控青蒿素生物合成相關的逆境脅迫因子信號傳導

除植物激素和光外，一些逆境因子，如鹽脅迫、浸水脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫等也對青蒿素的生物合成產生顯著影響，一定程度的鹽脅迫、浸水脅迫、低溫脅迫能促進青蒿素及其衍生物的積累，而干旱脅迫則減少積累[97]。逆境脅迫對青蒿素生物合成的調節作用與其促進相關酶基因表達及特定轉錄因子的參與有關，ABF1、APX、CCC1、CPK6、JAZ1、MYC2和JAZ5是潛在的響應因子[98]。研究表明，鹽脅迫促進和基因表達[99]，24 h浸水處理后和基因表達上調[100]，低溫促進青蒿素生物合成基因（、、、和）轉錄水平顯著提高、產生高濃度ROS促進青蒿素合成前體轉化、抑制競爭途徑β-石竹烯合酶基因表達，并通過誘導JA合成及提高JA信號相關轉錄因子AaERF1、AaERF2、AaORA的調控能力進一步上調青蒿素生物合成基因表達[101-102]。最近發現，AabHLH112是調控冷脅迫信號的重要轉錄因子，能通過轉錄因子AaERF1間接上調青蒿素生物合成基因表達[44]。而干旱脅迫下，、、、、等生物合成基因和轉錄因子基因表達下調[103]，過表達干旱脅迫相關轉錄因子，、、基因表達水平上調，青蒿素含量增加[52]。另據轉錄組分析也表明，轉錄因子在鹽、浸水、低溫、干旱等脅迫應激信號傳導中起著不可或缺的作用，有29個轉錄因子家族參與其中一種或多種脅迫，尤其是NAC和MYB/MYB相關家族的轉錄因子在上述4種脅迫中均發揮重要作用，是研究轉錄因子調控逆境脅迫信號傳導需要重點關注的家族[97]。

總體來說，目前對轉錄因子響應黃花蒿逆境脅迫的作用機制研究還不夠深入，而且青蒿素含量與脅迫程度、光照強度、黃花蒿生長狀態、收獲時間等多種因素有關，即使脅迫類型相同，因脅迫程度等因素差異也往往得出不一致的研究結果，如Lv等[52]、Marchese等[104]認為短期缺水有利于青蒿素積累，，基因表達提高3～7倍，而Vashisth等[97]、Yadav等[103]認為長期缺水抑制青蒿素的生物合成。

4 結語與展望

青蒿素作為治療瘧疾的特效藥，過去5年間需求量增長25%。近年來，化學合成、代謝工程、合成生物學、高產品種選育等研究為提高青蒿素產量提供了多種方案，但仍有不少難題尚未解決[105]。如化學合成的純青蒿素產品在藥效及耐藥性方面不及植物來源的青蒿素[106-107]，半合成方法生產青蒿素的成本較高、效率較低，影響了工業化進程[108]，代謝工程或選育的新品種優良性狀還不能穩定遺傳[3,11]。因此，迄今仍未建立一種高效、快速、經濟和大量生產青蒿素的有效方法，從植物提取依然是青蒿素生產的主要來源，高含量青蒿素品種的研發仍是解決當前困境的關鍵。

轉錄因子作為青蒿素生物合成的高效調控因子，具有調控等基因表達、腺毛形成與發育和激素等信號傳導的作用，在提高青蒿素含量或產量方面擁有巨大的潛力，然而利用轉錄因子提高青蒿素含量或產量的研究還未達到可商業化的目標。基于青蒿素生物合成相關轉錄因子主要在GSTs中表達，并與等基因表達模式高度一致，目前已利用激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）、RNA-seq及染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術對近40個轉錄因子進行克隆、表達及基本功能研究。最近，單細胞測序技術應用于構建基因網絡以鑒定在植物發育分化過程中起著關鍵作用的核心轉錄因子，以及解析轉錄因子對植物組織成分、細胞特性及分化的影響等方面顯示出廣闊的發展前景[109-110]，相信隨著該技術的應用及相關數據的增多，將大大加快候選轉錄因子的篩選和功能表征速度，有效提高轉錄因子的研究精度，增加對青蒿素生物合成轉錄因子調控網絡的認識。同時，先前青蒿素生物合成相關轉錄因子的研究大多注重靶基因結合位點分析，較少涉及表觀遺傳學研究，而Pandey等[111]研究表明UVB介導了基因啟動子中包括WRKY在內的7個轉錄因子結合位點的去甲基化，甲基化程度的降低顯著促進了基因上調表達和青蒿素合成。因此，注重轉錄因子/結構基因甲基化/去甲基化等表觀遺傳研究，可能開啟轉錄因子調控青蒿素生物合成途徑研究的新領域。此外，植物基因組中常有一些特定的具有相似表達模式的基因簇參與次生代謝調控，而黃花蒿基因組高度復雜，是典型的大基因組（1.74 Gb）、高雜合度（1.0%～1.5%）、高重復序列（61.57%）、低GC含量（僅31.5%）基因組，其中萜類合酶基因家族顯著擴張，是目前已測序植物物種中萜類合酶基因最多的物種之一[12]。從復雜的基因組中鑒定關鍵轉錄因子，特別是基因簇調控轉錄因子及其功能，將為尋找更有效的青蒿素生物合成相關轉錄因子提供更多機會。總之，通過多種方法構建青蒿素生物合成調控網絡，將豐富青蒿素代謝調控理論，助力青蒿素含量或產量進一步提高。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on transcriptional regulation mechanism of artemisinin biosynthesis

ZHAN Zhong-gen

Biopharmaceutical Laboratory, Zhejiang Institute of Economics and Trade, Hangzhou 310018, China

Artemisinin is an unusual novel endoperoxide sesquiterpene lactone isolated from medicinal plant, has been widely used to treat falciparum malaria. Due to increasing international demand and low content in wildplants, trying to enhance the content or yield of artemisinin become a hotspot. Transcription factors play important roles in regulating a series of genes in the metabolic pathway, and several families of transcription factors have been reported to participate in regulating the biosynthesis and accumulation of artemisinin, and the intervention of transcription factor by genetic engineering is an important method in enhancing the content or yield of artemisinin. Therefore, biosynthesis mechanism of artemisinin from regulating the initiation and development of glandular trichomes and regulating the biosynthesis of artemisinin by transcription factors were reviewed in this paper, in order to provide reference for the transcriptional regulation of artemisinin metabolism.

artemisinin; transcription factor; biosynthesis; trichomes initiation; hormone signal; light signal; adversity stress

R282.1

A

0253 - 2670(2022)19 - 6258 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.031

2022-06-09

浙江省自然科學基金資助項目（LGN18C200026）；浙江省省屬高校基本科研業務費項目（21SBYB08）

詹忠根（1971—），男，教授，碩士，研究方向為藥用植物生物技術。E-mail: zhzg9321@163.com

[責任編輯 崔艷麗]