基于高內涵篩選技術的吳茱萸次堿肝毒性研究

郭 麗，路青瑜，李 嬌，楊付梅，孫黔云

(貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodiaruteacarpa(Juss.) Benth var.Officinalis (Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodiaruteacarpa(Juss.) Benth.var.bodinier (Dode) Huang的干燥近成熟的果實。其性味辛熱、苦，有小毒，歸肝、胃、脾、腎經，能散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉，用于頭痛、腹痛、腳氣、腹瀉等，為溫中止痛的上品[1]。《本草綱目》中有提及吳茱萸的毒性：“有小毒，動脾火，病目者忌之”[2]。

作為貴州大宗藥材吳茱萸，吳茱萸次堿(ruteacarpine，RUT)是其主要成分，藥理學研究表明，RUT具有抗高血壓、抗癌、抗炎癥反應、抗抑郁、保護胃黏膜等多種藥理作用[3]。近年來隨著吳茱萸及其制劑在臨床上的使用率越來越高，因服用吳茱萸不當產生的毒性時有發生，曾出現1例報道因服用吳茱萸過量致死，在死者的血液中檢測到吳茱萸生物堿[4]。有文獻研究顯示[5]，吳茱萸的水提、醇提、揮發油3個組分都表現出了一定的肝毒性。RUT是吳茱萸的主要成分之一，有文獻報道稱其在高濃度下能使肝細胞培養上清中的AST、ALP和LDH水平升高，表現出明顯的肝毒性[6]，但其具體的肝毒性機制尚不清晰。課題組的前期篩選結果也表明，RUT對HepG2有明顯的毒性。本研究基于高內涵篩選技術開展了RUT對HepG2細胞的毒性作用及機制研究，以期為進一步認識RUT的毒性機制和臨床安全用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑胎牛血清來源于南美；RUT(PS000914)購于成都普思生物科技有限公司；DMEM培養基(8121371)購自美國Gibco公司；熒光染料Hoechst 33342(C1022)、Mitotracker Red CMXRos(C1049B)、DAPI(C1002)、活性氧檢測試劑盒(S0033S-1)、NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒(SN368)、鈣離子熒光探針Fluo-4 AM(S1060)購于江蘇碧云天生物技術研究所；DIR細胞膜染料(DD0408)購于江蘇宇恒生物科技有限公司；p38(8690s)、ERK 1/2(4695s)、p-ERK 1/2(4370s)、JNK(9252s)、p-JNK(9255s)、c-Fos(2250s)、c-Jun(9165s)、p-NF-κB p65(3033s)單克隆抗體(一抗)、Alexa Flour 488熒光標記山羊抗兔IgG、Alexa Flour 488熒光標記山羊抗鼠IgG抗體(二抗)購于美國CST公司；Alexa Flour 488熒光標記p-p38(sc-166182)、p-STAT3(sc-8059)和Alexa Flour 647熒光標記STAT3(sc-8019)抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；Annexin V-FITC試劑盒(556547)購于上海優寧維公司；阿霉素(D8740-25 mg)購于北京索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜，美國Sigma公司。

1.2 儀器高內涵篩選儀型號為CellInsight Cx5(美國賽默飛公司)；TS2-S-SM倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；NovoCyte 2040R流式細胞儀(美國ACEA公司)；連續波長酶標儀Gen5(美國基因公司)；賽默飛CO2培養箱(美國Thermo公司)；Milli-Q Integral 超純水系統(美國Milipore公司)。

1.3 細胞培養與實驗分組HepG2細胞來源于中國典型培養物保藏中心，生長于胎牛血清濃度為10%的DMEM高糖培養基中，培養在含有5% CO2，溫度為37 ℃的培養箱中。待HepG2細胞生長至80%～90%時，用0.25%的不含EDTA的胰酶將細胞消化下來，離心后用DMEM完全培養基調整細胞密度至1×108個·L-1，每孔100 μL細胞接種于Ⅱ型膠原包被的96孔板中，使得每孔的細胞數為1×104個[7]。RUT終濃度為5、10、25、50、100 μmol·L-1，阿霉素為陽性對照，終濃度為1.25、0.625 μmol·L-1，對照組為0.1% DMSO，每組設置2個復孔。

1.4 MTT法檢測HepG2細胞的活力將處于對數期的HepG2細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL(1.0×104個/孔)。置37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中培養24 h，給藥處理，每組設置3個復孔，分別繼續培養24、48 h后，每孔加入20 μL MTT后于37 ℃、5%的CO2細胞培養箱中孵育4 h后，然后再加入50 μL的三聯液充分溶解沉淀，過夜孵育后，使用酶標儀于570 nm波長處檢測其OD值。HepG2細胞的生長抑制率/%=[(實驗組OD570 nm-對照組OD570 nm)/對照組OD570 nm]×100%。

1.5 細胞ROS水平檢測給藥處理6、12、24、48 h后，分別向每孔中加入50 μL已預熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預熱至37 ℃ DCFH-DA染料，使得各染料的終濃度分別為5、10 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育30 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養基溶液。使用高內涵篩選儀采集圖像，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測DCFH-DA染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。

1.6 細胞線粒體膜電位檢測給藥處理3、6、12、24、48 h后，向每孔中加入50 μL已預熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預熱至37 ℃ Mito-Tracker Red CMXRos染料，使得各染料的終濃度分別為5、0.2 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養基溶液。使用高內涵篩選儀采集圖像，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于551 nm/576 nm檢測CMXRos染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。

1.7 細胞內鈣離子濃度檢測給藥處理3、6、12、24、48 h后，向每孔中加入50 μL已預熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預熱至37 ℃ Flou-4 AM染料，使得各染料的終濃度分別為5、10 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養基溶液。使用高內涵篩選儀采集圖像，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測Flou-4 AM染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。

1.8 細胞膜完整性檢測給藥處理3、6、12、24、48 h后，用預熱至37 ℃的完全培養基配制含有細胞核染料Hoechst 33342和DIR混合的活細胞染料，使得各染料的終濃度分別為5、500 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養基溶液。使用高內涵篩選儀采集圖像，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于742 nm/767 nm檢測DIR染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。

每年軍坡節，祭祀活動體現出情感的歷史積淀與文化傳承,潛在地影響著社會中每個人的行為方式，節日中的歷史認同是重要的歷史教育及愛國教育的德育資源。

1.9 MAPK、NF-κB、JAKs-STATs 信號通路活化水平檢測細胞給藥處理3、24 h后，用PBS洗滌細胞后，加入固定液固定15 min，洗滌液洗細胞3次，加入免疫熒光染色封閉液，室溫振蕩封閉1 h，吸棄封閉液，分別加入相應的抗體，p38(1 ∶200)、ERK 1/2(1 ∶800)、p-ERK 1/2(1 ∶400)、JNK(1 ∶200)、NF-κB p65(1 ∶400)、p-NF-κB p65(1 ∶400)、c-Jun(1 ∶200)、c-Fos(1 ∶3 200)和p-JNK(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，洗滌液洗3次，加入相應的二抗Alexa Flour 488山羊抗兔IgG(1 ∶500)與Alexa Flour 488山羊抗鼠IgG(1 ∶500)，室溫避光孵育1 h，DAPI染色20 min，洗滌3次，最后加入50 μL PBS，采用高內涵分析儀進行檢測，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測Alexa Flour 488，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。直標抗體p-p38(1 ∶50)、STAT3(1 ∶50)、p-STAT3(1 ∶50)直接室溫避光孵育3 h后，加入DAPI染色20 min，洗滌3次，最后加入50 μL PBS。使用高內涵篩選儀采集圖像，每組雙復孔，每孔采集12個視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測p-p38、p-STAT3，STAT3的通道波長設置為650 nm/647 nm，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統進行結果分析。

1.10 細胞凋亡情況的檢測將HepG2細胞接種到24孔細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2、100%濕度中培養，給藥處理48 h后，將24孔細胞培養板中培養基吸棄，用PBS洗滌1遍，胰酶消化7 min后加入培養基震蕩5 min，然后將細胞轉移到96孔V形板中，離心使細胞沉淀，吸棄上清，加入結合緩沖液將細胞洗滌一遍，離心吸凈緩沖液，加入20 μL(含1 ∶50的抗FITC Annexin V抗體和1 ∶20 PI)結合緩沖液，于37 ℃震蕩孵育30 min，加入200 μL結合緩沖液洗滌細胞，離心吸棄上清，然后加入200 μL結合緩沖液重懸后用流式細胞儀檢測。

1.11 統計學分析采用軟件SPASS 18.0進行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。

2 結果

2.1 RUT對HepG2細胞活力的影響RUT暴露于HepG2細胞，分別作用24、48 h后，與對照組相比，25、50、100 μmol·L-1均能使HepG2細胞活力顯著降低(P<0.01)，且具有劑量依賴性，而陽性藥物阿霉素組在所設濃度下細胞活力均有下降，差異具有顯著性(P<0.01)(Fig 1)。

2.2 RUT對HepG2細胞數目、核面積和DNA量的影響RUT分別作用于HepG2細胞24、48 h后，與對照組相比，100 μmol·L-1的RUT使HepG2細胞數目明顯減少(P<0.01)，5、10、25、50 μmol·L-1的RUT對HepG2細胞數目無明顯影響，RUT對DNA量和核面積無明顯變化(Fig 2)。

Fig 1 Effect of RUT on cell viability of HepG2 by MTT n=3)A：The cells were cultured with RUT for 24 h.B：The cells were cultured with RUT for 48 h.*P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 2 Effect of RUT on HepG2 cell number (A),DNA density (B),nuclear area (C) n=3)Nuc:nuclear **P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 vs control.

2.3 RUT對HepG2細胞氧化應激的影響100 μmol·L-1的RUT暴露于細胞6 h后就出現ROS水平顯著升高(P<0.01，Fig 3A)；24、48 h時，ROS的含量變化程度隨濃度的增大依次增加，表明RUT能快速誘導HepG2細胞ROS水平的上升，導致氧化應激損傷(P<0.01，Fig 3C,D)。

2.4 RUT對HepG2細胞線粒體膜電位、鈣離子內流和細胞膜完整性的影響RUT作用于HepG2細胞6 h后，與對照組相比，RUT 50、100 μmol·L-1使HepG2細胞鈣離子明顯升高(P<0.01，P<0.05，Fig 4A)，而相同濃度的RUT在6 h時間點會使得HepG2細胞細胞膜完整性被破壞(P<0.01，P<0.05，Fig 4B)，50、100 μmol·L-1RUT 組線粒體膜電位水平明顯降低(P<0.01，Fig 4C)。

Fig 3 Effect of RUT on ROS of HepG2 cells by high-content analysis n=3)A：The cells were cultured with RUT for 6 h with different concentrations.B：The cells were cultured with RUT for 12 h with different concentrations.C：The cells were cultured with RUT for 24 h with different concentrations.D：The cells were cultured with RUT for 48 h with different concentrations.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 4 Effect of RUT on calcium ion internal flow,cell membrane integrity and mitochondrial film potential of HepG2 by high-content analysis n=3)A and B：The cells were cultured with RUT for 6 h with different concentrations.C：The cells were cultured with RUT for 48 h with different concentrations.*P<0.05，**P<0.01 vs control.

2.5 RUT對MAPK信號通路活化的影響RUT作用HepG2細胞24 h后，與對照組相比，100 μmol·L-1RUT組和1.25 μmol·L-1ADR組p-ERK1/2、p-JNK、p-STAT3和p-p38的蛋白熒光強度明顯增強(P<0.01，P<0.05，Fig 6)，50 μmol·L-1RUT組的p-ERK1/2、p-JNK、p-STAT3和p-p38表達有上調(P<0.01，P<0.05，Fig 8)，而不同濃度RUT組總蛋白未見明顯變化。

2.6 RUT對AP-1信號通路的影響50、100 μmol·L-1RUT作用HepG2細胞3 h后，與對照組相比，AP-1相關蛋白c-Jun、c-Fos表達明顯上調(P<0.01)，25 μmol·L-1RUT組c-Fos表達上調(P<0.05)，其余濃度下c-Jun、c-Fos蛋白的表達未見明顯上調(Fig 9，10)。

2.7 RUT對NF-κB信號通路活化的影響HepG2細胞暴露于100 μmol·L-1RUT作用3 h后，磷酸化NF-κB p65水平明顯升高(P<0.01，Fig 11C)，細胞核內熒光強度/細胞質熒光強度(nuc/cyt fluorescence intensity)比值與對照組相比未見明顯差異(Fig 11B)。

2.8 RUT對HepG2細胞凋亡的影響不同濃度的RUT處理HepG2細胞48 h，隨著濃度的增加，發生早期凋亡的細胞比例逐漸增加，100 μmol·L-1RUT組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01，Fig 12)，在10、25、50 μmol·L-13個濃度下均引起細胞凋亡(P<0.05，Fig 12)。

Fig 5 Effect of RUT on levels of p-Erk/Erk (A) and p-JNK/JNK (B) of HepG2 cells by high-content screening assay(×200)

Fig 6 Effect of RUT on levels of p-Erk/Erk (A) and p-JNK/JNK (B) of HepG2 cells for 24 h by high-content screening *P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 7 Effect of RUT on levels of p-STAT3/STAT3 (A) and p-p38/p38 (B) of HepG2 cells by high-content screening assay(×200)

Fig 8 Effect of RUT on levels of p-STAT3/STAT3 (A) and p-p38/p38 (B) of HepG2 cells for 24 h by high-content screening n=3)*P<0.05，**P<0.01;##P<0.01 vs control.

Fig 9 Effect of RUT on levels of c-Jun and c-Fos of HepG2 by high-content screening assay(×200)

Fig 10 Effect of RUT on levels of c-Jun and c-Fos of HepG2 for 3h by high-content screening n=3)**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 vs control.

3 討論

在臨床用藥歷程中，中藥肝毒性損傷(drug-induced liver injury，DILI)和腎毒性一樣，是一種臨床上常見的藥物不良反應，它的毒性在藥物性靶器官毒性中排第二位，僅僅次于心臟毒性[8]。肝臟作為藥物解毒的一個重要靶器官，承受著藥物產生的毒性，隨著中藥在臨床上的廣泛應用，以及近年來中藥毒理學研究的不斷深入，使用中藥導致的肝損傷問題報道越來越多，這一點引起了人們的高度重視，中藥導致肝損傷問題已經成為了在中藥使用過程中不得不注意的問題。藥物的肝毒性研究在藥物發現早期評價階段起著至關重要的作用，而高內涵篩選技術是近年來在藥物活性篩選和早期安全性評價領域得到了廣泛應用的研究技術，通過利用熒光顯微鏡成像自動化和圖片集成分析，可以達到藥物早期毒性監測與監控，這也是新藥研發必不可少的一部分[9]。我們在前期篩選中發現RUT對HepG2細胞表現出明顯的毒性，考慮到吳茱萸藥材和含有吳茱萸的制劑在臨床上的廣泛應用，以及近年來吳茱萸安全性事件的報道時有發生，因此，本研究采用高內涵技術，開展了RUT對HepG2細胞毒性的作用和機制研究，以期為吳茱萸及吳茱萸制劑的臨床應用和安全性提供參考依據和數據支撐。

本研究發現[10]，RUT暴露于HepG2細胞后，其細胞活力和細胞數目減少，細胞膜完整性被破壞，細胞出現凋亡，呈現初步的毒性反應。研究結果顯示，由細胞內的氧化自由基、過氧化氫和其下游的氧化物等產生的ROS，調控著許多生理和病理過程，是常見的細胞凋亡通路影響因素。進一步對Ca2+內流、線粒體膜電位和ROS的追蹤，顯示Ca2+發生了明顯的內流，線粒體膜電位紊亂，其ROS水平顯著上調，炎癥相關蛋白出現磷酸化，這表明在一定條件下，RUT對HepG2細胞表現出一定的毒性，而其機制可能與RUT引起的氧化應激和炎癥反應導致的細胞損傷有關。有研究顯示通過抑制ROS引起的線粒體氧化應激，可使得細胞凋亡率明顯下降[11]，當細胞在受到有毒的物質刺激時，其內的ROS含量會突然升高，從而誘發了細胞的氧化應激，使得相關通路開放，凋亡因子被激活，細胞DNA被損壞，最終引起細胞凋亡[12]。線粒體膜電位作為細胞凋亡早期的一個重要指標，在特定信號的刺激下會發生紊亂，線粒體通透性改變，細胞質中產生的一些與凋亡相關的因子會影響到線粒體的正常功能[13-14]。

Fig 11 Effect of RUT on levels of translocation of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 of HepG2 for 3 h by high-content screening n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control.

本研究發現，MAPK、NF-κB和JAKs-STATs信號通路被激活，它們是細胞內炎癥密切相關的3條信號通路，并且它們之間有著復雜的交互作用。絲裂原活化激酶信號通路MAPK是涉及多種炎癥反應的一條重要的信號通路，它在細胞內壓力、紫外線和生長因子等的刺激下被激活而發揮相應的作用，通過調節細胞的過度增殖、生長分化、細胞的凋亡和細胞的自噬過程來調控細胞的生長，MAPK主要由JNK、p38和ERK這3條信號通路構成[15]。MAPK信號通路的激活可以促進轉錄因子如NF-κB和AP-1的活化并加重炎癥反應，AP-1被激活后，組成AP-1的兩個亞基c-Jun和c-Fos蛋白表達量會明顯增多，并會轉化成有活性的磷酸化形式，在靶基因啟動子或增強子區域相應結合位點上發揮重要的轉錄作用[16]。NF-κB是體內重要的轉錄因子，通常以p50和p65組成異源二聚體的形式存在于細胞內，NF-κB p65活化后能夠使得多種黏附分子、炎癥細胞因子、趨化因子的活化，在免疫調節和炎癥相關反應以及細胞生長等方面起重要作用[17]。STAT3是JAKs-STATs信號通路的一個重要組成部分，可以通過調節線粒體相關的蛋白來介導細胞凋亡，在細胞各種各樣的活動中扮演著重要的作用[18]。在本研究中，100 μmol·L-1RUT可明顯增加ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平，AP-1相關蛋白c-Jun和c-Fos的表達均有明顯上升，提示RUT可能通過激活MAPK信號通路，使得AP-1的轉錄活性上調，從而引發后續的炎癥級聯反應。與對照組相比，HepG2細胞暴露于100 μmol·L-1RUT后，磷酸化NF-κB p65水平明顯上升，但是其核轉位強度不明顯，其原因可能與檢測的時間點和p-NF-κB p65的入核過程被抑制有關。在本研究中，100 μmol·L-1RUT可增強STAT3的磷酸化水平，表明JAKs-STATs信號通路被激活。這3個信號通路在引起RUT對HepG2細胞損傷中的相互調控關系仍需進一步的深入研究。

Fig 12 Effects of different concentrations of RUT for 48 h on early n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control.

本研究結果表明，HepG2細胞暴露于RUT后，會引起細胞內ROS升高、鈣內流強度增強，線粒體膜電位紊亂、而其細胞膜完整性被打破，造成細胞氧化應激損傷，引發炎癥MAPK、NF-κB和JAKs-STATs信號通路的炎癥級聯反應，進而導致HepG2細胞的損傷和凋亡。

(本論文研究是在貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心孫黔云課題組完成。)