豬布魯氏菌病流行病學調查及3種檢測方法比較

方來杉 李莎莎 黃文華 王寶珍 南平市延平區農業農村局 福建 南平 353000

布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌屬的布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染性疫病[1]。是OIE規定必須報告的B類動物傳染病，我國將其列為二類動物疫病。目前發現布魯氏菌易感動物有60多種，包括禽類、哺乳類和人類。其中牛、豬、羊是畜間布魯氏菌的主要傳染源，嚙齒動物如鼠、野兔和豚鼠也能攜帶布魯氏菌，是養殖場不可忽視的傳染源。目前發現的豬布魯氏菌（Brucella Suis）有5個生物型，其中1、2、3型可以引起豬發病，4、5生物型可引起其他動物發病[2]。由于不同種的布魯氏菌具有宿主轉移特性，羊種、牛種布魯氏菌亦可引起公豬睪丸炎、附睪炎和關節炎，母豬流產、死胎和不孕等癥狀。豬群主要經呼吸道、生殖道及破損皮膚、黏膜感染豬布魯氏菌病，20周齡以下豬只具有一定的抵抗能力，隨著日齡增大，感染該病的風險更大[3]。

常用的布魯氏菌病診斷方法有三種：血清學方法、細菌學方法和分子生物學方法，血清學方法與后兩者相比，操作簡便、成本低廉、便于大批量臨床樣品監測。血清學方法包括虎紅平板凝集試驗（RBPT）、熒光偏振試驗（FPA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、試管凝集試驗 （SAT）、補體結合試驗（CFT）和膠體金等。2018年9月已實施的《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2018）將iELISA和cELISA納入了國家標準，cELISA可以區分疫苗接種和野毒株感染。

本研究通過血清學診斷方法了解延平區規模豬場豬布病抗體陽性率情況，為了確保布病檢測結果準確，減少漏診、誤診情況，同時對3種布病血清學檢測方法進行比對試驗。本研究目的是通過準確的檢測結果與分析，進而掌握延平區豬布魯氏菌病的發病情況，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液來源2022年4～5月從延平區12個鄉鎮各隨機選擇1個規模化豬場，每個豬場各采集30份血清樣品，共采集360份樣本，12家豬場均未免疫豬布魯氏菌病疫苗。

1.1.2 試劑儀器 虎紅平板凝集試驗：虎紅平板凝集抗原（哈爾濱維科生物技術有限公司，批號2022001）、受檢陰性血清、布魯氏菌標準陽性血清、玻璃平板。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測試劑盒（浙江迪恩生物科技有限公司，批號82011）、布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒 （北京中海生物科技有限公司，批號20220401/1）、50 μL可調移液器、一次性移液器槍頭等。

1.2 方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗 參考《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646-2018)的方法，具體如下：將被檢血清0.03 mL與抗原0.03 mL相混合，4 min內觀察結果。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗iELISA和cELISA試驗均按各自試劑盒的使用說明書進行操作。

2 結 果

2.1 虎紅平板凝集試驗初篩結果 從圖1可知，虎紅平板凝集反應中標準陰性血清樣本（B4）無凝集現象，液體均勻渾濁。標準陽性血清（C4）、A1、B1和B2樣品呈現有明顯的凝集顆粒，A3、A4、C1和C3樣品可見有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明。A2、B3和C2樣品液體均勻渾濁，無凝集現象。

圖1 部分虎紅平板凝集試驗結果

由表1可知，12個鄉鎮的12家規模場的虎紅平板凝集試驗共檢出陽性血清樣本54份，抗體陽性率為15%，其中C鄉鎮的豬布病抗體陽性率為13.33%；D鄉鎮的豬布病抗體陽性率高達100%；G鄉鎮的豬布病抗體陽性率為66.67%。

表1 規模豬場布病虎紅平板凝集試驗結果

2.2 間接ELISA和競爭ELISA試驗結果 將虎紅平板凝集試驗初篩出的54份抗體陽性血清樣本，再次進行虎紅平板凝集試驗，同時也將54份抗體陽性血清樣本進行間接ELISA和競爭ELISA復核試驗。由表2可知，初篩得到的54份抗體陽性血清樣本的RBPT抗體陽性率為100%，可排除因玻璃平板污染的因素。然而間接ELISA和競爭ELISA試驗均無抗體陽性血清樣本檢出。RBPT容易受待檢血清質量、反應溫度、試驗人員主觀因素等影響，而ELISA作為我國現行國標推薦方法，特異性強。在臨床監測豬布魯氏菌病工作中，必須使用多種布病檢測方式方能確保檢測結果的可靠性。

表2 三種血清學檢測方法的比較

3 分析與討論

本次試驗結果顯示，南平市延平區12家規模豬場尚無豬布魯氏菌病。雖然本地區未發現有豬布魯氏菌病，但本地區為福建省畜牧養殖大縣（區），擁有95家左右大中小型養豬場、14家規模化乳牛場、總存欄量約1萬多頭以及眾多零星散養的養羊戶，各鄉鎮的豬場處于較為復雜的養殖環境，做好豬布魯氏菌病的監測調查工作不容松懈。布魯氏菌病影響人和家畜動物的健康，進而對養殖業和人類公共衛生造成巨大的安全隱患。

本次試驗數據顯示，RBPT法與iELISA、cELISA相比出現了較高的假陽性，特異性較低。其中D、G兩鄉鎮假陽性率分別為100%、66.67%。RBPT法有較高的誤診率，主要原因如下：一是，抗凝劑對RBPT有顯著影響，在乳酸緩沖液下血漿中的纖維蛋白原會與虎紅試劑（四氯四碘熒光素）發生非特異性凝集反應，造成極高的假陽性率[4]，因此，不可用血漿進行布魯桿菌病RBPT檢測；二是，反應溫度對RBPT的影響，RBPT所用的抗原需要恢復至室溫，血清放置回溫時間越短、溫度越低，假陽性率越高；三是，血清的藥物濃度、試驗人員操作的規范性、嚴謹性等均在一定程度影響試驗的準確性。

在臨床監測豬布魯氏菌病工作中，必須使用多種布病檢測方式，盡量減少漏診、誤診情況的出現。同時，加強基層獸醫人員的采血技術培訓，按照要求采集血清樣本，不可用血漿代替血清。布病是人畜共患病，目前主要防治措施是采取檢疫凈化，檢測結果真實可靠對于防治該病具有至關重要的作用。