一例豬藍耳病與豬圓環病毒病及多重細菌共感染的實驗室診斷

黃喜榮 陳羽璇 張鑫杰 薛少華 呂紫欣 蒙 寧 戴愛玲,2,3＊

（1.龍巖學院生命科學學院 福建 龍巖 364000；2.福建省生豬疫病防控工程技術研究中心 福建 龍巖 364000；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室 福建 龍巖 364000）

豬藍耳病又稱為豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬繁殖障礙和呼吸系統的高度接觸性傳染病。可通過唾液、公豬精液、糞便、母豬垂直傳播等方式傳播，傳播范圍很廣，極難防控。我國華北地區于1995年從加拿大進口的種豬中首次分離出該病毒[1]。豬圓環病毒（Porcine Circovirus，PCV）為目前發現的最小動物病毒之一，無囊膜，含共價閉合的單股環狀負鏈DNA。目前已報道四種豬圓環病毒。豬圓環病毒1型無致病性，2型具有致病性，并且二者在豬群中廣泛存在，3型、4型的致病性尚不確定[2]。2型是豬圓環病毒相關疾病 （Porcine circovirus associated disease，PCVAD）的主要病原體，極易感染哺乳期和保育期的豬而致病，一般不造成直接死亡，而是導致豬免疫力下降，耐過后終身帶毒。斷乳仔豬多系統衰竭綜合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）是PCVAD的最常見形式，感染早期的PMWS豬群平均病死率為20%～40%，晚期PMWS感染最初發生在8～12周齡，主要臨床癥狀是腹瀉，一般與沙門氏菌共感染，其病死率高達80%[3-4]。在豬圓環病毒相關疾病中以斷乳仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）影響最為嚴重，給世界豬業帶來巨大損失，同時在PMWS發生過程中豬繁殖與呼吸綜合征病毒也起著非常重要的作用。豬藍耳病和豬圓環病毒病都是免疫抑制病，能導致患豬對疫苗的免疫反應降低，進一步增加對其他傳染病的易感性，使動物長期處于亞臨床狀態[5]。Rovira A等[6]通過共感染試驗證明，PRRSV感染可促進PCV2的增殖，Harms P A等[7]發現PCV2能夠加重PRRSV引起的支氣管肺炎病理變化，這是引起二者共感染并造成巨大危害的主要原因。有研究對華東四個省份127份母豬繁殖障礙、仔豬呼吸困難的病料進行PCR檢測，發現PRRSV與PCV2共感染病例占52.3%，表明二者有極高的共感染率[8]。

本研究對2021年福建省龍巖市某規模豬場發生的一例保育豬出現呼吸困難、咳嗽、消瘦等癥狀的病例進行綜合診斷。該豬場存欄1 000頭，其中母豬200頭，2021年10月保育豬出現體溫升高、精神低迷、呼吸困難、食欲不振、消瘦等臨床癥狀，部分仔豬皮膚發紺，嚴重的腹式呼吸、腹瀉、高熱，個別仔豬死亡速度快，死前有四肢劃動的神經癥狀，發病率達30%左右，病死率達60%以上。臨床解剖發病保育仔豬，發現氣管有大量膿性黏液，肺臟腫脹、肺臟表面有纖維素性滲出，心包炎，全身淋巴結腫脹，肺門淋巴結出血；肝臟、腎臟表面有少許出血點；膀胱、扁桃體、脾臟無明顯臨床眼觀病變。該豬場豬瘟、豬偽狂犬病均按照正常的免疫程序進行免疫接種；藍耳病采取一年統一免疫三次藍耳病滅活疫苗、二次活疫苗（PC株）的免疫方式，仔豬不免疫；豬圓環病毒2型疫苗采取母豬不免疫，仔豬14～15日齡免疫基因工程疫苗（原核表達）的免疫方式；全場沒有免疫相關細菌性疫苗。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與處理 對龍巖市某規模化豬場送檢的3頭患豬進行臨床剖檢，無菌采集發病豬的肝臟、肺臟深層組織，接種于含血清和NAD的TSA培養基，37℃恒溫培養箱倒置培養24 h，觀察菌落生長情況。

無菌采集患豬肝臟、肺臟、淋巴結、脾臟、腎臟，按照剖檢順序進行編號，-80℃凍存、備用。

1.2 主要儀器ABI Veriti 96孔梯度PCR儀，購自ABI公司；MiniProTM EpBasic基礎型電泳儀，購自翌圣生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自青島英賽特有限公司；反轉錄試劑、2×Taq Master plus Mix、2×Phanta Flash Master Mix、膠回收試劑盒及DH5α，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL 2000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；革蘭氏染色試劑，購自北京陸橋技術有限公司；DH5α感受態細胞，購自上海唯地生物技術有限公司。

1.4 引物設計與合成 根據Genbank已公布的多個不同PCV2基因型序列設計用于PCV2檢測的引物；根據標準[9]合成能夠擴增PCV2基因組1 154 bp長度（序列分析）的引物對；根據PRRSV多個參考毒株設計用于PRRSV檢測并能同時擴增ORF5全長的引物；細菌16S rRNA擴增引物參照文獻進行合成[10]，CSFV和PRV檢測用引物分別根據文獻[11]和標準[12]合成，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。各引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 方法

1.5.1 病毒核酸提取 將采集的組織病料剪碎后置于2 mL EP管中，加入等體積滅菌PBS，置于組織研磨儀研磨，經反復凍融3次，離心取出上清，上清組織懸液立即用于核酸提取或置于-80℃保存。

參照病毒DNA/RNA共提取試劑盒說明書，提取樣品DNA/RNA，DNA/RNA立即用于PCR反應或置于-80℃備用。

根據反轉錄試劑說明書對提取的樣品RNA進行反轉錄，反轉錄獲得的cDNA立即用于RT-PCR試驗或置于-20℃備用。

1.5.2 PCR或RT-PCR檢測 以提取的樣品DNA為模板對PCV2、PRV進行PCR檢測，PCR擴增體系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，樣品DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PCV2及PRV檢測的上下游引物各1 μL；PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，61℃/65℃（PCV2/PRV）退火30 s，72℃延伸45 s，共設置35個循環，72℃充分延伸5 min。

以反轉錄的cDNA為模板對PRRSV、CSFV進行RT-PCR檢測，RT-PCR擴增體系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，樣品cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PRRSV及CSFV檢 測 的 上 下 游 引 物 各1 μL；RT-PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃/55℃（PRRSV/CSFV）退 火30 s，72℃延伸50 s，共設置35個循環，72℃充分延伸5 min。PCR和RT-PCR擴增產物均用2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5.3 目的片段的克隆及序列分析 使用高保真酶分別對PCV2、PRRSV及所分離細菌的16S rRNA進行擴增。以陽性樣品DNA為模板對PCV2目的片段進 行PCR擴 增，PCR擴 增 體 系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣 品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PCV2目的片段擴增上下游引物各2 μL；PCR反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，62℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設置35個循環，72℃充分延伸1 min。

以陽性樣品cDNA為模板對PRRSV ORF5進行PCR檢測，PCR擴增體系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣品cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PRRSV目的片段擴增上下游引物各2 μL；PCR反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，53℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設置35個循環，72℃充分延伸1 min。

挑取24 h過夜培養的單菌落，應用水煮模板法提取細菌核酸。以提取的細菌核酸為模板對細菌16S rRNA進行PCR擴增，PCR擴增體系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，目的片段擴增上下游引物各2 μL；PCR反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，61℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設置35個循環，72℃充分延伸1 min。應用2%瓊脂糖凝膠電泳試驗對上述擴增產物進行鑒定。

根據膠回收試劑盒說明書對上述PCR產物進行純化回收，將回收產物鏈接至pMD-19T載體，并轉化至DH5α感受態細胞，篩選陽性菌落。將陽性菌落送至廣東睿博興科公司進行測序，測序結果用DNAstar軟件的Megalin進行序列分析，并應用MEGA7軟件的鄰接法繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定 無菌采集發病豬的肝臟、肺臟深層組織進行細菌分離，結果顯示，肉眼觀察到血平板上出現三種形態不同的菌落，經革蘭氏染色后1號和3號菌株為革蘭氏陰性菌，2號菌為革蘭氏陽性菌。

2.2 PCR或RT-PCR檢測結果 對3份患豬組織樣品的PRRSV和PCV2核酸進行檢測。PRRSV檢測結果顯示，1號樣品在750 bp左右出現目的條帶（見圖1a），2號、3號樣品均未擴增出與預期大小一致的條帶；PCV2檢測結果顯示，1～3號樣品均在666 bp處有特異性條帶（見圖1b），均與預期結果相符。對樣品CSFV、PRV核酸進行檢測，結果顯示3份樣品CSFV、PRV病原核酸均為陰性。結果表明1號患豬檢出了PRRSV和PCV-2病毒核酸，2號、3號患豬檢出了PCV2病毒核酸。

圖1 PRRSV、PCV2 PCR擴增結果

2.3 PCV2、PRRSV同源性序列分析與遺傳進化分析

2.3.1 PRRSV序列分析 將測序所得1號樣品毒株命名為ZGD-PRRSV，通過Genbank上所公布PRRSV參考毒株的ORF5基因序列進行序列比對發現，所獲得ZGD-PRRSV ORF5序列長度為603 bp，為美洲型毒株。序列比對結果顯示，ZGDPRRSV株與國內HP-PRRSV代表毒株JXA1、JAX1-p170、HuN4的相似性最高，為93.4%～94.0%；與參考毒株VR2332、CH1-a的核苷酸同源性為89.8%～89.9%；與NADC30、NADC34和QYYZ分支的毒株相似性較低，為81.7%～85.8%。 與參考毒株的遺傳演化分析結果顯示（見圖2），ZGD-PRRSV毒株ORF5基因與HP-PRRSV代表毒株JXA1、HUN4、TJM-F92、CH-1R等處于同一分支，親緣關系較近，為高致病性毒株；與國內目前主要流行的NADC30-like PRRSV代表毒株NADC30、CHsx1401、FJZ03具有一定的遺傳距離，親緣關系較遠。

圖2 PRRSV ORF5遺傳進化分析

2.3.2 PCV2序列分析 應用DNAStar對1～3號樣品PCV2測序結果進行鑒定，結果顯示，1～3號樣品PCV2核苷酸同源性為100%，均為同一毒株。將測序所得1～3號樣品毒株命名為ZGD-PCV2，并與GenBank中登錄的27株PCV2參考毒株進行序列比對及遺傳進化分析，序列比對結果顯示，與法國及西班牙參考毒株AY322004、GU049340.1的同源性最高，為96.1%～98.4%；與天津、廣東、福建地區參考毒 株AY181946、AY682994.1、DQ180393的 同 源 性為92.7%～93.6%；與丹麥、江蘇參考毒株EU148505、MG732801.1的同源性較低，為91.0%～92.7%。 遺傳進化分析結果顯示（見圖3），ZGD-PCV2與法國及西班牙參考毒株AY322004、GU049340.1親緣關系較近，同屬于PCV2a亞型；與福建本地毒株DQ180393有較遠的遺傳距離，親緣關系較遠。

圖3 PCV2遺傳進化分析

2.4 細菌16S rRNA的PCR鑒定與測序 分別對所分離3個菌株的16S rRNA進行擴增，結果顯示，1～3號菌株均在1 484 bp左右出現特異性條帶（見圖4）。對所獲得3個菌株的16S rRNA進行克隆測序，BLAST快速比對結果顯示，1號細菌與肺炎克雷伯菌16S rRNA的核苷酸同源性達99.9%以上；2號菌與豬鏈球菌16S rRNA的核苷酸同源性達99.9%以上；3號細菌與O157:H7血清型大腸桿菌（腸致病性）16S rRNA的核苷酸同源性達99.9%以上。

圖4 16S rRNA的PCR鑒定結果

3 結論與討論

根據臨床癥狀、病理剖檢、病原學檢測，判定該豬場發病豬PRRSV、PCV2共感染，并發感染豬鏈球菌、肺炎克雷伯菌等，表明藍耳病與圓環病毒病共感染且并發細菌病是該次疫情的主要原因；序列分析表明，感染的PRRSV為HP-PRRSV株，PCV2毒株為PCV2a亞型。

本試驗檢測的3份樣品中，1份檢出PRRSV與PCV2共感染，2份只檢出PCV2感染，表明豬場圓環病毒感染比較嚴重。近年來，隨著豬場規模化和集約化程度不斷提高，豬場和豬群密度較大，病毒病或多種病毒共感染的發生率越來越大[8,11,13]。PRRSV與PCV2共感染在病毒性感染中危害最為嚴重，能夠造成豬群的雙重免疫抑制，抵抗力下降，從而易引起細菌繼發感染[14]。在臨床生產中，對豬藍耳病和圓環病毒病的有效防控尤為重要。但由于PRRSV毒株具有遺傳多樣特征，現有藍耳病弱毒疫苗免疫后不能提供有效的免疫保護，免疫后可抑制野毒復制，降低病毒血癥水平和排毒，但不能阻止野毒感染，只能減輕臨床癥狀。PRRS嵌合病毒活疫苗（PC株）和藍耳病滅活疫苗聯合免疫，雖然有報道在藍耳病防控方面有一定的效果，但還需要在臨床上持續跟蹤[15-16]。對于該豬場病例，核苷酸同源性與遺傳進化分析結果表明，該毒株與HP-PRRSV分支有較近的親緣關系，因此，免疫同源性較高的高致病性藍耳病疫苗株如JAX1-R株、HuN4-F112株等，可以提供更為有效的保護作用，減少經濟損失。 豬圓環病毒病疫苗有全病毒滅活疫苗和亞單位基因工程疫苗，現有商品化疫苗主要以PCV2a毒株為基礎[17]，該豬場感染的PCV2毒株為PCV2a基因型，雖然毒株同源性高，但疫苗使用效果除受生產工藝、毒株、病毒含量、佐劑、滅活劑影響外，還受免疫頻次、機體健康等因素影響，有效的疫苗免疫才可以明顯降低病毒血癥，減輕臨床發病癥狀[18]。豬鏈球菌、肺炎克雷伯菌、腸致病性大腸桿菌等在豬場是一種條件致病菌，常在豬體抵抗力下降時才表現發病癥狀。

調查發現，該豬場對母豬采取一年統一免疫三次藍耳病滅活疫苗、二次活疫苗（PC株），仔豬未免疫藍耳病疫苗；母豬未免疫豬圓環病毒病疫苗，仔豬14日齡免疫基因工程疫苗（原核表達）。雖然該豬場有接種疫苗，但缺乏后期相應的免疫監測，無法評估制定的免疫程序的合理性。此外，豬場受非洲豬瘟疫情影響，許多工作重心在生物安全措施管理方面，忽略了10月份是秋冬交替之際，南方山區晝夜溫差大，斷乳后保育豬的保溫管理沒有及時調整，導致保育豬在多重應激下發病。

針對該次疫情，豬場及時隔離患豬，淘汰無治療價值患豬，對有治療價值的豬選擇肌注磺胺間甲氧嘧啶鈉和頭孢噻呋，群體添加抗生素如替米考星、阿莫西林和中藥制劑如玉屏風顆粒和麻杏石甘顆粒，連用15 d（用量根據說明書）；同時加強生物安全防控和飼養管理，在保持欄舍通風保溫前提下，減少晝夜溫差，執行全進全出，保育舍至少空欄2周。建議豬場仔豬出生后用鹽酸頭孢噻呋做保健，預防斷臍、剪牙、斷尾、斷乳過程中因傷口或應激引起細菌感染；建議近期懷孕母豬產前免疫2次豬圓環病毒病疫苗，以后全場一年免疫3～4次。1個月后對豬場進行回訪，該豬場疫情得到有效改善，保育豬死亡率明顯下降，說明該方案行之有效。