雞肉中氟喹諾酮類殘留液質(zhì)檢測方法比對

周偉靚 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心 福州 350003

氟喹諾酮（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）又稱新喹諾酮，是一種新型的喹諾酮類（Quinolone，QNs）衍生物，具有吸收性好、抗菌譜廣、抗菌作用強、半衰期長、使用方便、價格低廉等優(yōu)點，在防治動物各類型感染性疾病中被廣泛使用。但由于使用過程中不規(guī)范用藥，近年來耐藥率已高達約60%，對人體可造成直接危害甚至致癌。目前對FQs類藥物殘留的檢測方法主要有微生物檢測法、色譜儀器分析法、免疫分析法和化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)發(fā)光分析法等。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法特異性更強，具有靈敏度、準(zhǔn)確度更高和分析范圍更廣的特點，適用于雞肉中FQs類藥物殘留量的測定。本試驗是將國標(biāo)法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定FQs類藥物殘留量的前處理步驟進行優(yōu)化，可在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性前提下，省時省力、降低檢測成本，大幅提高前處理檢測工作效率。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設(shè)備 天平（梅特勒-托利多，感量0.01 g）、分析天平（梅特勒-托利多，感量0.00001 g）；冷凍離心機（美國科俊）；固相萃取裝置、氮吹儀（美國Organomation）；渦旋混合器（德國IKA）；Waters TQ-S UPLC/MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（沃特世）；微 孔 濾 頭0.22 μm（島 津）；旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 儀（Buchi）。

1.2 試劑、材料 標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NFX），均購自Dr.公司，純度均≧98%；色譜純甲醇（默克公司）、色譜純乙腈（默克公司）、色譜純甲酸 （阿拉丁公司）；Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱（200 mg/6cc）、Waters Oasis HLB（200 mg/6cc）；50 mL聚四氟乙烯離心管（Thermo）；雞肉樣品；水為二次蒸餾水。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相條件 色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm），粒 徑：1.7 μm，進 樣 量：1 μL，流 速：0.40 mL/min，流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件 掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；離子源：電噴霧離子源（ESI＋）；離子源溫度：150℃；離子源噴霧電壓：0.5 kV；霧化溫度：350℃；霧化氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：150 L/h。監(jiān)測離子對：恩諾沙星360.2＞245.0（CV/CE 32/20），360.2＞316.1（CV/CE 32/22）；環(huán)丙沙星332.1＞288.3（CV/CE 36/17），332.1＞314.2（CV/CE 36/19）；諾氟沙星320.3＞276.3（CV/CE40/17），320.3＞302.3（CV/CE40/19）。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 取FQs類標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用0.1%甲酸乙腈/水溶液（3/7，v/v）稀釋制成濃度分別 為1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。依次從低濃度到高濃度測定，按其所得峰面積與對應(yīng)的對照溶液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的回歸方程及相關(guān)系數(shù)表明，在1～200 μg/L濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

1.4 前處理方法與步驟

1.4.1 方法一 按照GB/T 20366-2006《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》前處理方法。

1.4.2 方法二 準(zhǔn)確稱取（2±0.02）g試料于50 mL離心管內(nèi)，加入80%乙腈水溶液8.0 mL，渦旋1 min，高 速 振 蕩 提 取5 min，9 000 r/min離 心10 min。取上清液4.0 mL直接加載到PRiME HLB固相萃取柱中，無需活化和平衡，保持流速1滴/s，收集全部流出液。于45℃下氮吹至體積小于1.0 mL，用10%甲醇水溶液定容至1.0 mL，渦旋混勻，吸取適量過0.2 μm微孔濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍和最低檢測限 配制FQs類標(biāo)準(zhǔn)工作液高、中、低濃度系列，3 d內(nèi)重復(fù)測定3次，得3條標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星在2.5～500 μg/L濃度具有良好線性關(guān)系。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的最低檢出限分別為1.0 μg/kg、1.0 μg/kg、0.8 μg/kg。

2.2 回收率試驗 取FQs類標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，分別添加至空白雞肉樣品中， 使成10.0 μg/kg、50.0 μg/kg和100.0 μg/kg的加標(biāo)回收試驗，每個濃度平行測定2個，結(jié)果見表3。

表3 恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星藥物殘留加標(biāo)回收率（n=2）

3 分析與討論

在采用GB/T 20366-2006《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》前處理方法時發(fā)現(xiàn)，即使用9 000 r/min離心5 min，提取2次，合并上清液至分液漏斗中，部分樣品仍存在乳化嚴(yán)重問題，不好液液萃取。分離出下層液后，接著于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，最后用氮氣流吹干，準(zhǔn)確加入1.0 mL 2%甲酸乙腈溶液溶解殘渣，渦流混勻后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。方法一前處理6個樣品的時間約為6 h，步驟較為繁雜，耗時耗力。經(jīng)優(yōu)化后的方法二，樣品提取液9 000 r/min離 心10 min，過PRIME HLB固 相 萃 取 柱（200 mg/6cc），收集液經(jīng)氮吹定容即可直接供上機測定，前處理6個樣品的時間約為2 h，大大降低了FQs類殘留藥物的檢測難度，省時省力。在不同濃度梯度的加標(biāo)回收率試驗中，對前處理方法一和方法二分別做單點定量，進行回收率測定對比。加標(biāo)濃度在10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg時，前處理方法二的回收率在可信范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，具有良好的分離度和重現(xiàn)性，與GB/T 20366-2006《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的試驗方法效果相近。

4 結(jié) 語

國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)健委、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定了恩諾沙星+環(huán)丙沙星在禽肉中的MRL值為100 μg/kg，農(nóng)業(yè)部第2292號公告規(guī)定諾氟沙星在禽肉中禁用。優(yōu)化后的方法二能夠非常方便地對微量濃度的FQs類藥物殘留進行檢測，并能夠滿足我國目前對FQs類藥物殘留的常態(tài)化檢測工作要求，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，可節(jié)約運行成本、保質(zhì)保量，進一步提升對食品安全的風(fēng)險預(yù)警監(jiān)測能力。