不同射流霧化器對銀黃吸入溶液體外霧化特性評價的影響

李翠，溫遠珍，曹暉，華杰，李婷，楊靜，許彥

[1.暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2.盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司/國家中藥現代化工程技術研究中心新型遞藥系統分中心/廣東省霧化吸入制劑工程技術研究中心，廣東 珠海 519000；3.浙江維康藥業股份有限公司，浙江 麗水 323000]

吸入液體制劑系指供霧化器用的液體制劑，即通過霧化器產生連續供吸入用氣溶膠的溶液、吸入混懸液、吸入用溶液（需稀釋后使用的濃溶液）和吸入用粉末（需溶解后使用的無菌藥物粉末）[1]。吸入液體制劑具有局部給藥，起效迅速、使用方便，避免肝臟首過效應，減少全身給藥可能產生的不良反應等優點，是治療哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病（COPD）等疾病較為有效的途徑，因此市場前景廣闊[2-3]。

銀黃注射液由金銀花、黃芩提取物組成，被廣泛應用于上呼吸道感染、急慢性咽炎、急慢性扁桃體炎等外感性疾病的治療，國內臨床上有將其霧化吸入用于治療呼吸系統疾病的報道，療效顯著[4]。目前，國內尚無中藥霧化吸入溶液上市。盡管臨床上有不少中藥注射液采用霧化吸入給藥，治療呼吸道疾病效果良好的報道，但均為超說明書范圍使用，存在安全隱患。銀黃吸入溶液在已上市銀黃注射液的基礎上改良開發而成，含金銀花、黃芩提取物，目前處于臨床前研究階段。

吸入液體制劑的療效除與藥物自身理化性質有關外，所使用霧化器的性能亦是重要的組成部分。目前，市售霧化器按照工作原理分為射流霧化器、超聲霧化器和振動篩孔霧化器3類，其中射流霧化器是使用最廣泛的霧化器，主要有以下幾方面優勢：①可使藥液微粒直徑在5 μm以下，到達小氣道及肺泡，達到高效的吸入；②不產生高溫，無藥物應用限制；③藥液量較少，最大藥液量一般為8 mL；④霧化時間較短[5-6]。

遞送速率、遞送總量和空氣動力學粒徑分布是評價體外霧化特性的重要指標。空氣動力學粒徑分布是評估吸入制劑是否有效霧化的關鍵體外質量控制項目，《中國藥典》2020年版使用新一代撞擊器（NGI）作為吸入溶液劑空氣動力粒徑分布（aerodynamic particle size distribution,APSD）的測量儀器。目前，常用的空氣動力學評價參數微細粒子劑量（fine particle dose,FPD）、微細粒子分數（fine particle fraction,FPF）、空氣動力學質量中值粒徑（mass median aero-dynamic diameter，MMAD）和幾何標準偏差（geometric standard deviation,GSD）。遞送速率及遞送總量是評價藥物遞送效率的重要依據[7-8]。本研究采用呼吸模擬裝置模擬正常成人的呼吸模式，考察5種不同品牌、型號的射流霧化器對銀黃吸入溶液體外評價的影響，以期優選出適合銀黃吸入溶液性能的最佳霧化器，為中藥霧化吸入給藥的體外評價提供借鑒。

1 儀器與試藥

1260 InfinityⅡ超高液相液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器，Open-LAB工作站，美國安捷倫公司）；SQP型（十萬分之一）電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；BRS2100呼吸模擬器（英國科普利公司）；SB-1637新一代藥物撞擊器（NGI，英國科普利公司）；LCP-5真空泵（英國科普利公司）；TPK-2100流量控制器（英國科普利公司）；冷卻裝置（英國科普利公司）；DFM2000電子流量計（英國科普利公司）；Master-s15型純水機（上海和泰儀器有限公司）；BRS濾膜（英國科普利公司）；MOC濾膜（英國科普利公司）。

霧化器A、B、C、D、E分別是市場上常用的5種品牌或型號射流霧化器。

銀黃吸入溶液[批號：CP-201229-01，盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司]；黃芩苷對照品（批號：110715-201821，純度：95.4%，中國食品藥品檢定研究院）；水為去離子水，甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷的含量測定

2.1.1 色譜條件Welch Ultimate?XB-C18為色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-磷酸（體積比50∶50∶0.2）為流動相；檢測波長為274 nm；進樣量為10 μL。按外標法以峰面積計算樣品中黃芩苷含量，理論板數按黃芩苷峰計算應不低于2 500。色譜圖見圖1。

圖1 銀黃吸入溶液的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Yinhuang solution for inhalation

2.1.2 對照品溶液的制備取黃芩苷對照品10.56 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備精密量取本品1 mL置10 mL量瓶中，加入50%（體積分數，下同）甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 標準曲線的建立精密量取不同體積的黃芩苷對照品適量，加50%甲醇稀釋至刻度，并制成質量濃度為12.26、24.52、49.04、98.08、201.5 μg/mL的系列對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線Y=33.762 6X-76.094 6（r=0.999 7），線性范圍為0.122 6～2.015 μg。

2.1.5 精密度試驗取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算黃芩苷峰面積的RSD＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗取同一批銀黃吸入溶液，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果黃芩苷含量的RSD＜2.0%，表明方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗取同一批銀黃吸入溶液，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、16、24、36、48 h按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果黃芩苷峰面積的RSD＜2.0%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗精密吸取已知黃芩苷含量的銀黃吸入溶液，加入一定量的對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，按外標法計算回收率。結果平均加樣回收率為98.66%，RSD為2.0%，表明方法準確度良好。

2.2 霧化特性測定洗滌溶液的考察

含量測定中使用50%甲醇作為供試品溶液制備的稀釋溶劑，由于甲醇毒性較大，采用甲醇溶液作為洗滌溶劑會對操作員的身體造成傷害，因此，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，稀釋溶劑分別為20%乙醇溶液與50%甲醇溶液，對比兩種溶液對黃芩苷含量測定的影響，結果20%乙醇溶液與50%甲醇溶液黃芩苷含量分別為4.703 mg/mL和4.796 mg/mL，兩者偏差＜2%，說明無明顯差異，選擇20%乙醇溶液作為洗滌溶液。

2.3 數據處理

采用SPSS 22.0統計學軟件處理，數據均采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.4 微細粒子空氣動力學特性的測定

參照2020年版《中國藥典》四部通則0951測定法[1]進行檢測。預先使冷柜降至5℃，將NGI放置冷柜中90 min，開啟真空泵并調節流速至15 min/L。精密量取銀黃吸入溶液2 mL，置入霧化杯中，連接裝置，開啟霧化器霧化15 min，關閉霧化器和真空泵。分別用20%乙醇洗滌各部件，霧化器洗滌液置50 mL量瓶，人工喉、Stage1～2、Stage7和MOC洗滌液置5 mL量瓶，Stage3、Stage6洗滌液置10 mL量瓶，Stage4、Stage5洗滌液置20 mL量瓶，用20%乙醇稀釋至刻度，使用高效液相色譜法測定各部件洗滌液中黃芩苷含量。按上述方法選用不同霧化器進行檢測，每個霧化器平行測定3次，將各部件洗滌液測定結果導入到CopleyCitdas V3.10軟件計算，可得FPD、FPF、MMAD及GSD。測定裝置見圖2，測定結果見表1及圖3。

圖2 微細粒子空氣動力學特性測定裝置Figure 2 Device for measuring aerodynamic characteristics of fine particles

圖3 不同霧化器的微細粒子空氣動力學特性氣泡圖Figure 3 Bubble chart of fine particle aerodynamic characteristics of different nebulizers

表1 不同霧化器的空氣動力學分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

表1 不同霧化器的空氣動力學分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列數據比較，不同字母間表示差異有統計學意義，即P＜0.05。

霧化器霧化器A霧化器B霧化器C霧化器D霧化器E FPD/mg 4.212±0.8a 2.802±6.0b 2.664±3.9b 2.682±6.9b 1.755±9.4c FPF/%69.753±2.3a 50.995±2.9b 51.896±2.7b 50.062±4.0c 46.882±3.3d MMAD/μm 3.534±2.9a 4.776±3.9b 4.676±2.6b 4.832±3.6c 5.096±3.1d GSD 1.896±0.3a 2.148±1.7b 2.136±0.5b 2.150±1.5b 2.068±0.8b

根據結果可知，霧化器A和霧化器E與其他型號霧化器差異有統計學意義，氣泡圖顯示為離散點。霧化器B、霧化器C和霧化器D霧化器之間差異無統計學意義，氣泡圖顯示為聚集點。綜合空氣動力學結果最佳的是霧化器A，測得MMAD及GSD值最小，FPD及FPF值最大，說明MMAD最小，粒徑分布最窄，小于5 μm的氣溶膠藥物的質量及占比最大。空氣動力學結果最差的是霧化器E。霧化器B、霧化器C和霧化器D 3個型號霧化器結果介于兩者中間。

2.5 遞送速率和遞送總量的測定

參照2020年版《中國藥典》四部通則0111的方法[1]，組裝過濾器和呼吸模擬器。將2 mL本品注入霧化杯中，由適配器連接霧化器與過濾裝置，確保所有連接處密封。調節呼吸模擬器按成人模式運行（潮氣量500 mL，吸呼比1∶1，頻率：15 r/min，波形：正弦曲線）。同時開啟霧化器和呼吸模擬器，60 s時關閉霧化器，取出吸入濾膜1，用20%乙醇溶液沖洗稀釋至10 mL。更換新的吸入濾膜2，同時開啟霧化器和呼吸模擬器，直至霧化結束（霧化15 min），關閉霧化器，用20%乙醇溶液沖洗霧化杯、吸入濾膜2及呼出濾膜，稀釋至50 mL。采用高效液相色譜法測定上述洗滌液中黃芩苷含量，遞送速率為吸入濾膜1中黃芩苷含量與霧化時間的比值，遞送總量為吸入濾膜1和2中黃芩苷含量之和，呼出總量為呼出濾膜中黃芩苷含量，藥杯殘留為霧化杯中黃芩苷含量，回收率為測得總量（各部件中黃芩苷含量總和）與給藥量的百分比。按上述方法選用不同霧化器進行測定，每個霧化器平行測定3次。測定裝置見圖4，測定結果見表2。

表2 不同霧化器的遞送數據Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

表2 不同霧化器的遞送數據Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列數據比較，不同字母間表示差異有統計學意義，即P＜0.05。

霧化器霧化器A霧化器B霧化器C霧化器D霧化器E遞送速率/（μg·s-1）7.258±3.3a 14.334±2.1b 14.766±10.7b 7.526±8.2a 7.955±9.6a遞送總量/mg 2.806±5.2a 3.580±3.2b 2.649±7.2a 2.826±7.0a 1.276±9.9c呼出總量/mg 0.526±16.6a 1.262±7.3b 0.434±11.4a 0.509±12.1a 0.097±8.7c藥杯殘留/mg 6.219±4.4a 5.592±2.4b 5.209±0.42b 5.000±14.0b 6.090±3.2a回收率/%95.50±0.9a 104.39±0.7b 82.93±3.1c 83.603±4.7c 74.69±1.5d

圖4 遞送速率和遞送總量測定裝置圖Figure 4 Device diagram for measuring delivery rate and total delivery

結果發現，霧化器C遞送速率最快，與霧化器B的遞送速率差異無統計學意義，其余3款霧化器的遞送速率差異無統計學意義。由遞送總量和呼出總量結果可知，霧化器B最高，霧化器E最低，其余3款霧化器差異無統計學意義。霧化器E遞送總量和呼出總量值低的原因是實驗過程中發現該款霧化杯無上蓋，不能密封，在霧化過程中，大量霧化液滴從霧化杯上口噴出，導致收集到活性物質少。藥杯中殘留量最少的是霧化器D，霧化器D、霧化器B和霧化器C藥杯殘留量差異無統計學意義，霧化器A藥杯中殘留量最多。霧化器A及霧化器B的回收率均大于95%，說明該霧化器上蓋的設計可有效阻止霧化液滴在呼氣時噴出，且采用上述洗滌方式可以將各部件中的黃芩苷收集完全，濾膜對藥物無吸附作用。

3 討論

霧化吸入療法是呼吸系統相關疾病的重要治療手段之一，因其臨床應用優勢被國內外廣泛使用。肺部是霧化吸入給藥的重要作用部位，但并非所有藥液經霧化后，霧化顆粒都能沉積肺部，進入呼吸道的粒子會發生慣性碰撞、沉降和擴散，粒子的粒徑、形態和密度是決定粒子沉積的重要因素[9-10]。霧化顆粒直徑對藥物沉積位置有直接影響，有效霧化顆粒直徑應在0.5～10 μm。其中粒徑5～10 μm的霧粒主要沉積于口咽部，粒徑3～5 μm的霧粒主要沉積于肺部，粒徑1～3 μm的霧粒50%～60%沉積于肺泡，而粒徑＜1 μm的微粒吸入肺內后大部分又隨氣流呼出。綜上，粒徑1～5 μm的粒子在肺部沉降率最高，一般被選作霧化吸入制劑的主要組成部分，能夠發揮最大的臨床療效[11-13]。

空氣動力學粒徑分布（APSD）可反映已形成的藥物霧滴在人體肺部環境中的粒徑分布情況，有利于評估吸入藥物在臨床應用中的安全性及有效性；可確定霧粒進入口腔并能到達肺部的粒子比例，還預測粒子在肺部發生沉積的位點。APSD的主要指標有FPD（微細粒子劑量）、FPF（微細粒子分數）、MMAD（空氣動力學質量中直徑）和GSD（幾何標準偏差）。FPD為空氣動力學粒徑小于5 μm的氣溶膠藥物粒子的質量，描述了可能進入肺部的藥物粒子的質量。FPF通常指藥物在肺部沉積百分比。MMAD是指大于和小于該空氣動力學直徑的粒子質量各占總質量的一半，是衡量“平均”粒徑的有效工具。GSD為累積分布低于84.1%和15.9%粒子的空氣動力學直徑（μm）比值，理想氣溶膠的GSD值為1，但大多數藥物的氣溶膠是非均相的，GSD值一般在1.5～2.5[8]。本研究選用的5種射流霧化器均能產生MMAD≤5 μm的霧化效果。

目前，上市的空氣射流霧化器品種眾多，本研究選擇了目前市場上常用的5種品牌或型號壓縮空氣式霧化器對銀黃吸入溶液的遞送速率、遞送總量和APSD進行測定，綜合各項評價指標可知，不同霧化器的體外霧化特性有顯著差異，可能是由于不同霧化器所配備的壓縮機功率不同及霧化杯的構造不同造成。如霧化器E配套的霧化杯無上蓋，霧化過程有霧粒噴出，導致遞送總量和呼出總量值偏低；霧化器A和霧化器B為采用同一壓縮機，只是位于霧化杯內部的內芯不同，體外霧化特性也有明顯差異，霧化器A的APSD各項指標均優于霧化器B，但遞送速率、遞送總量均小于霧化器B。綜合比較遞送速率、遞送總量和APSD等指標測評結果，霧化器B和霧化器C的有效微細粒子沉積較多，粒徑分布較窄，遞送速率和遞送總量較大，適合銀黃吸入溶液的臨床使用。

另外，本實驗僅對同一種類型的霧化器進行了考察，發現采用同一種模型藥物得出的結果有顯著性差異，因此建議在霧化吸入制劑研發過程中，應考慮到不同類型、品牌、型號霧化器對霧化性能效果的影響，對擬選用的霧化器進行全面性能考察，以確保霧化吸入制劑臨床使用的療效。