基于傳統煎藥工藝的錦燈籠飲片標準湯劑質量研究

邢海燕，李曉亮，張潔，李成網

（1.合肥市第二人民醫院（安徽醫科大學附屬合肥醫院），安徽 合肥 230012；2.安徽九方制藥有限公司，安徽 亳州 236800；3.安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230061）

錦燈籠是茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或者帶果實的宿萼。苦，寒，歸肺經，具有清熱解毒、化痰利咽、利尿通淋的功效［1］。錦燈籠主要含有甾體類、甾醇類、生物堿類、氨基酸類及其他類型化合物［2-4］。研究表明錦燈籠具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、利尿、免疫調節、鎮痛等藥理活性，作為一種清熱、解毒藥被廣泛應用于臨床［5-8］。

中藥配方顆粒既符合中醫辨證論治，又具有免煎煮、起效快、攜帶方便、安全衛生等特點而被臨床越來越廣泛使用［7-9］。同時也存在著質量標準不高，臨床有效性和合理性尚需要進一步驗證等問題［9-11］。國家藥品監督管理局于2021年發布了《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，明確提出了標準湯劑的概念。標準湯劑［12］是指以傳統中醫藥理論作為指導，選取主產區藥材或道地藥材，經加工炮制而成合格飲片后，按照臨床應用時傳統湯劑的煎煮方法，參照現代中藥提取方法制備而成的單味中藥飲片水煎劑。將“標準湯劑”作為中藥配方顆粒的標準參照物，來衡量與臨床湯劑是否基本一致，目前尚未有錦燈籠標準湯劑的質量評價方法的相關文獻報道。

以市售5個主產地15批錦燈籠飲片為材料，遵循標準湯劑制備方法，用標準化工藝制備標準湯劑，并以木犀草苷為指標成分，考察其在標準湯劑中的含量，計算轉移率、出膏率，并建立了標準湯劑的指紋圖譜，為建立錦燈籠飲片標準湯劑的質量標準提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀（Thermo公司），配 置LPG-3400A四 元 泵、DAD檢 測 器、WPS-3000TSL自動進樣器、TCC-3000SD柱溫箱；QUINTIX125D型電子天平（德國SARTORIUS公司），ATX124電子分析天平（SHIMADZU公司）；LC-12N-100B真空冷凍干燥機（南京鑫之曼葉設備有限公司）；RE5002型減壓旋轉蒸發器（江蘇省常州恩培儀器有限公司）；KM-615B超聲清洗機（江蘇省常州市科盟儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

木犀草苷（批號：111720-201810；純度：93.5%）、木犀草素（批號：111520-201605；純度：99.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；酸漿苦味素A（批號：180301-025；純度：98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇色譜純（MERCK化學試劑公司）、其他試劑均為分析純，水為超純水。15批5個不同產地錦燈籠藥材均由亳州廣源堂中藥飲片有限公司提供。藥材詳細信息見表1。

表1 藥材來源信息Table 1 The sources information sheet of Physalis Calyxseuf Ructus

2 方法與結果

2.1 錦燈籠飲片的檢測

按照2020年版《中國藥典》“錦燈籠”飲片項下有關規定進行檢測［1］，15批錦燈籠飲片的性狀、鑒別及含量等均符合藥典規定，其中含水量為6.1%～7.8%、木犀草苷含量為0.12%～0.35%。

2.2 基源鑒定

經安徽中醫藥大學生藥學系劉守金教授鑒別，15批錦燈籠基源均為茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的 干 燥宿萼或帶果實的宿萼，基源符合2020年版《中國藥典》規定。

2.3 標準湯劑的制備[11]

稱取各批次錦燈籠飲片100 g，分別加12倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火保持微沸30 min，200目篩網過濾；藥渣再加10倍量水煎煮25 min，合并2次濾液，經50℃減壓濃縮至150 mL的流浸膏，于冰柜冷凍（-40℃）后，再放入冷凍干燥機中干燥，得標準湯劑凍干粉，測定其水分、出膏率。水分按照《中國藥典》2020年版四部通則0832項下第二法測定，計算：出膏率=［標準湯劑凍干粉/飲片質量］×100%，結果見表2。

表2 錦燈籠標準湯劑凍干粉水分、出膏率的考察Table 2 The moisture，extractum rate of freeze-dried powder Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.4 錦燈籠標準湯劑中木犀草苷含量研究

2.4.1 對照品溶液的制備精密稱取木犀草苷對照品，加甲醇配制成含木犀草苷20 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備精密稱取各批次錦燈籠標準湯劑凍干粉約0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷后再稱定質量，用70%甲醇補足失去的質量，搖勻，濾過，即得。

2.4.3 色譜條件色譜柱：phenosphere luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：350 nm；進樣量：20 μL；理論板數按木犀草苷峰計算應不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 含量測定試驗中的高效液相色譜圖Figure1 HPLC chromatograms in content determination test

2.4.4 線性關系考察精密稱取適量木犀草苷對照品，加70%甲醇分別制成每1 mL約含6、12、24、48、96 μg的對照品溶液，吸取上述溶液各20 μL，按“2.4.3”項下色譜條件測定峰面積，以木犀草苷濃度（μg/mL）為橫坐標（X），350 nm波長下峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算標準曲線回歸方程為Y=0.951X+1.0267，R2=0.999 9。

2.4.5 精密度考察取錦燈籠標準湯劑供試品溶液（批號：2006001Y），按照“2.4.3”項下色譜條件連續進樣6次，測定木犀草苷峰面積的RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩定性考察取錦燈籠標準湯劑的供試品溶液，按照“2.4.3”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算木犀草苷峰面積的RSD為0.47%，表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

2.4.7 重復性考察取同一批錦燈籠標準湯劑凍干粉，平行制備6份錦燈籠標準湯劑供試品溶液，按照“2.4.3”項下色譜條件進樣，計算供試品溶液中木犀草苷含量RSD為0.13%，表明本方法的重復性良好。

2.4.8 加樣回收率考察精密稱取已知含量錦燈籠標準湯劑6份，分別精密加入等量木犀草苷對照品，按“2.4.3”項下色譜條件進樣，測定并計算木犀草苷的加樣回收率為103.7%，RSD值為2.0%。

2.4.9 樣品測定按照“2.4.3”項下色譜條件，測定15批錦燈籠標準湯劑、飲片中木犀草苷含量，按照W×X/M×100%計算木犀草苷的轉移率，其中，W為標準湯劑中木犀草苷的含量，X為飲片出膏率，M為飲片中木犀草苷的含量。見表3。

表3 錦燈籠標準湯劑和藥材木犀草苷含量及轉移率Table 3 The luteoloside content and transfer rate of Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 色譜條件phenosipherelunaC18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）、0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件詳見表4，流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；色譜圖見圖2。

圖2 指紋圖譜試驗中的對照品、供試品溶液色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms in fingerprint spectrum test

表4 梯度洗脫條件Table 4 Gradient elution program

經查閱文獻并與對照品色譜圖比對后，指認出2、4、6號峰分別為木犀草苷、木犀草素、酸漿苦味素A。木犀草苷為含量測定指標成分，且其含量高、穩定，故選擇2號峰為參照峰（S），以此計算標準湯劑中主要特征峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD值。

2.5.2 對照品溶液制備精密稱取木犀草苷、木犀草素及酸漿苦味素A對照品適量，加70%甲醇配制成濃度分別為50、70、50 μg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備精密稱取各批次錦燈籠標準湯劑凍干粉末約0.2 g，分別置25 mL容量瓶中，加70%甲醇超聲溶解60 min，放冷后定容，搖勻，經0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.5.4 精密度試驗取錦燈籠標準湯劑供試品溶液（批號：2006001Y），按照“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6次，以木犀草苷峰為參照（S峰），計算10個共有峰的相對峰面積及相對保留時間的RSD值，結果均小于2%（n=6），表明本法精密度良好。

2.5.5 穩定性試驗取錦燈籠標準湯劑供試品溶液（批號：2006001Y），分別于0、3、6、9、12、15、24 h注入液相色譜儀，記錄10個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD值分別為0.02%～0.10%和0.41%～1.71%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.6 重復性試驗取錦燈籠標準湯劑（批號：2006001Y）粉末，研細，按“2.5.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，記錄10個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.04%～0.08%和1.21%～1.98%，均小于2%，表明該方法重復性良好。

2.5.7 指紋圖譜的建立取15批錦燈籠飲片標準湯劑凍干粉各適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，同時按“2.5.1”項下色譜條件進樣，依法測定，采用國家藥典委員會公布發行的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）軟件”，對色譜圖進行整體相似度評價，得到指紋圖譜（圖3）；該軟件通過均值法和中位數法，合成具有代表性的指紋圖譜作為對照圖譜，采用夾角余弦法計算樣品指紋圖譜與對照圖譜之間的夾角余弦相似度作為評價指標，相似度在0.9～1.0之間視為符合要求，結果見表5。確定了10個共有峰，15批標準湯劑相似度均大于0.9，表明各批錦燈籠標準湯劑具有良好的特征性及穩定性，符合指紋圖譜相似度要求。

表5 15批錦燈籠標準湯劑相似度評價結果Table 5 Similarity evaluation of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

圖3 15批錦燈籠標準湯劑HPLC指紋圖譜Figure 3 HPLC fingerprint spectrum of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

3 討論

本研究依據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》及《醫療機構中藥煎藥室管理規范》，基于傳統煎藥工藝，利用現代生產提取設備制備錦燈籠飲片標準湯劑，并對其進行質量標準研究。按照《中國藥典》2020年版的方法，選取木犀草苷為錦燈籠標準湯劑的指標成分。15批不同產地的飲片中木犀草苷含量存在一定差異（范圍：0.13%～0.35%），含量波動范圍較寬泛，真實反映出錦燈籠飲片市場的情況。15批標準湯劑出膏率范圍在16.0%～24.1%之間，平均出膏率為21.2%，RSD為1.91%，表明本實驗的制備工藝成熟、穩定可靠。

木犀草苷為錦燈籠的主要有效成分，可溶于熱水、熱甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，微溶于水；參照2020年版《中國藥典》“錦燈籠”項下方法［1］，采用HPLC測定錦燈籠標準湯劑中木犀草苷的含量來進行質量控制，并進行了方法學考察，結果表明：該方法針對性強、效果良好；在標準湯劑制備的過程中，錦燈籠中木犀草苷的平均轉移率為42.8%，轉移率范圍約為±10.0%［12-13］。

錦燈籠中除含有木犀草苷成分外，還含有有機酸類等其他成分，如僅以木犀草苷作為本品質量評價指標，就不能完整地反映錦燈籠化學組分特征。指紋圖譜能夠全面地體現中藥質量，是目前控制中藥質量的公認評價模式［14-17］。本實驗采用HPLC法，建立了錦燈籠標準湯劑的指紋圖譜，方法學考察結果表明此方法準確度高、重復性良好。指紋圖譜的建立克服了單一成分木犀草苷信息量不足的缺陷，可更加全面控制錦燈籠標準湯劑的質量。本研究為錦燈籠配方顆粒的生產、質量控制及評價，提供了切實可行的試驗數據依據。