一測多評法同時(shí)測定外用金黃散提取物中7種成分的含量

肖新玉，楊小燕，施文婷，張?zhí)m蘭

（1.佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528225；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528225）

外用金黃散是佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院根據(jù)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，由多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的有效方劑，基礎(chǔ)方源于明代陳實(shí)功所著《外科正宗》，由大黃、黃柏、姜黃、白芷、天花粉、生天南星、蒼術(shù)、厚樸、陳皮、甘草十味藥組成，具有清熱燥濕、活血化瘀、消腫止痛、收濕斂瘡的功效，臨床上主要用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性乳腺炎、急性闌尾炎等的治療[1-2]。外用金黃散在原方基礎(chǔ)上增加了乳香、冰片等四味藥材，增強(qiáng)了活血化瘀、消腫生肌的功效。目前，關(guān)于金黃散的研究較多集中于提取工藝和藥理作用方面[3-6]；2020年版《中國藥典》規(guī)定如意金黃散的定量指標(biāo)為姜黃素、小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、和大黃素甲醚7種，采用3種色譜方法，較為復(fù)雜[7]；姚遠(yuǎn)等[8]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）法同時(shí)測定如意金黃散中12種成分，所需對照品種類較多，檢測成本較高。

一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single-marker,QAMS）借助相對校正因子，只需測定一個(gè)成分（內(nèi)標(biāo)物），可實(shí)現(xiàn)對多個(gè)有效成分的定量分析，在提高檢測效率的同時(shí)降低了檢測成本，已在中藥質(zhì)量控制方面得到廣泛應(yīng)用[9]。QAMS法在建立過程中，需要通過測定內(nèi)標(biāo)物與其他待測成分的峰面積和濃度，計(jì)算內(nèi)標(biāo)物與其他待測成分的相對校正因子，相對校正因子是實(shí)現(xiàn)QAMS法的關(guān)鍵參數(shù)，所以在建立該方法時(shí)相對校正因子的取值標(biāo)準(zhǔn)選擇尤為重要。此外，計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測值之間的相似程度還與選定的內(nèi)標(biāo)物與其他待測成分間化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的差異關(guān)系密切[10]。本研究通過建立一測多評法，以蘆薈大黃素為內(nèi)標(biāo)物，同時(shí)測定外用金黃散提取物中甘草苷、橙皮苷、甘草酸、大黃酸、歐前胡素和大黃素甲醚的含量，以期為外用金黃散提取物的質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；Waters Arc型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國默克公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷（批號：111610-201908，純度為95.0%）、橙皮苷（批號：110721-202019，純度為95.3%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度為96.2%）、蘆薈大黃素（批號：110795-201710，純度為98.3%）、大黃酸（批號：110757-201607，純度為99.3%）、歐前胡素（批號：110826-201918，純度為99.0%）、大黃素甲醚（批號：110758-201817，純度為99.2%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純（德國默克公司）；磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑為分析純。9批外用金黃散提取物（編號：S1～S9）由廣東一方制藥有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[11]

色譜柱：Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～16 min，19%～24%A；16～20 min，24%～30%A；20～30 min，30%～46%A；30～42 min，46%～55%A；42～60 min，55%～62%A；60～65 min，62%～19%A；65～70 min，19%A；）；檢測波長：280 nm（0～20 min，甘草苷、橙皮苷）、254 nm（20.01～70 min，甘草酸、蘆薈大黃素、大黃酸、歐前胡素、大黃素甲醚）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

分別取甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨、蘆薈大黃素、大黃酸、歐前胡素、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為92.598 6、77.334 8、65.154 6、72.999 8、85.880 0、64.184 6、66.844 8 μg/mL的混合對照品儲(chǔ)備液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.0207）。

2.3 供試品溶液的制備

取外用金黃散提取物約0.4 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷后再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1?？梢姡鞒煞稚V峰均具有良好的分離度，與對照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且未在相應(yīng)陰性樣品中檢測出，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of specificity test

2.4.2 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，加甲醇稀釋制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄甘草苷、橙皮苷、甘草酸、蘆薈大黃素、大黃酸、歐前胡素、大黃素甲醚的峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，表明各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Results of linear relationship investigation

2.4.3 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得各色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取外用金黃散提取物（編號：S1），精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得各色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取外用金黃散提取物（編號：S1），精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測定，計(jì)算得各色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)取同一批次已知成分含量的外用金黃散提取物共9份，分為3組，每份取約0.2 g，精密稱定后置于錐形瓶中，分別按低、中、高濃度精密加入混合對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別是：甘草苷101.6%（RSD=1.81%）、橙皮苷99.8%（RSD=2.44%）、甘草酸99.3%（RSD=1.90%）、蘆薈大黃素97.7%（RSD=2.42%）、大黃酸97.7%（RSD=2.91%）、歐前胡素101.0%（RSD=3.30%）和大黃素甲醚99.1%（RSD=1.60%），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 外用金黃散提取物中7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of sample addition recovery rate of 7 components in Jinhuang powder for external use

2.5 相對校正因子的確定[12-13]

精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以蘆薈大黃素為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算其他6種成分的相對校正因子（fs/k），公式為fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs），其中As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，Ak為待測成分峰面積，Ck為待測成分質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 不同濃度對照品溶液中各成分的相對校正因子Table 3 Relative correction factors of various constituents of different concentration of standard sample solution（n=7）

2.6 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性研究

2.6.1 不同色譜系統(tǒng)及色譜柱對相對校正因子的影響[14]以蘆薈大黃素為內(nèi)標(biāo)物，考察其他6種成分在Waters Arc型、Thermo U3000型2種高效液相色譜系統(tǒng)，以及Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）、YMC Triart C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）3種色譜柱下的相對校正因子，結(jié)果見表4?？梢?，各成分的RSD均小于3%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對各成分相對校正因子無顯著影響。

表4 不同色譜系統(tǒng)、色譜柱下各成分的相對校正因子Table 4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 不同柱溫對相對校正因子的影響[14]采用Thermo U3000型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察柱溫25、30、35℃對各成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表5?？梢?，不同柱溫條件下各成分的RSD均小于3%，表明柱溫對各成分相對校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫下各成分的相對校正因子Table 5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 不同流速對相對校正因子的影響[14]采用Thermo U3000型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察流速0.8、1.0、1.2 mL/min對各成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表6?？梢?，不同流速條件下各成分的RSD均小于3%，表明不同流速對各成分相對校正因子無顯著影響。

表6 不同流速下各成分的相對校正因子Table 6 Effects of different flow rates on relative correction factors

2.6.4 不同進(jìn)樣體積對相對校正因子的影響[14]采用Thermo U3000型高效液相色譜儀、Waters Xbridge C18色譜柱，考察進(jìn)樣體積2、4、6、8、10、15 μL對各成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表7?？梢姡鞒煞值腞SD均小于3%，表明進(jìn)樣體積的波動(dòng)對各成分相對校正因子無顯著影響。

表7 不同進(jìn)樣體積下各成分的相對校正因子Table 7 Effects of different injection volume on relative correction factors

2.7 待測成分色譜峰的定位[15]

在QAMS的應(yīng)用中，目前常用的色譜峰定位方法有相對保留值法、保留時(shí)間差法、時(shí)間校正法、對照提取物法等。本研究采用相對保留時(shí)間進(jìn)行待測組分色譜峰的定位，以蘆薈大黃素為內(nèi)標(biāo)物，考察其他6成分在Thermo U3000型和Waters Arc型2種高效液相色譜系統(tǒng)，以及3根不同廠家的色譜柱（Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX Extend-C18、YMC Triart C18）的相對保留時(shí)間，結(jié)果見表8?？梢?，各成分的RSD均小于3%，表明采用相對保留值法對待測成分的定位是可行的。

表8 不同色譜系統(tǒng)、色譜柱下各成分的相對保留時(shí)間Table 8 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.8 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

取9批外用金黃散提取物適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，利用SPSS 20.0軟件對兩組檢測結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，結(jié)果見表9。可見，2種方法的含量測定結(jié)果基本一致，相關(guān)系數(shù)r均為1.000。甘草苷、橙皮苷、甘草酸、大黃酸、歐前胡素、大黃素甲醚的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為2.86%～3.60%、0.83%～1.04%、0.15～3.10%、0.74%～3.86%、0.23%～4.03%、0.02%～4.02%，均小于5.0%，表明2種方法計(jì)算結(jié)果無明顯差異。

表9 外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果比較Table 9 Comparison of results obtained by external standard method and QAMS method（n=3） w/%

3 討論

目前，中藥化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量和種類仍不能滿足質(zhì)量檢測的需要，實(shí)際應(yīng)用中常采用分別測定有效成分含量的方法來控制中藥及其制劑的質(zhì)量，檢測效率較低，檢測成本偏高。一測多評法利用中藥中各成分間的相對校正因子同時(shí)測定多個(gè)有效成分，實(shí)現(xiàn)了在對照品缺乏的情況下進(jìn)行中藥多成分的質(zhì)量控制，顯著降低了檢測成本，提高了工作效率，對于中藥及其制劑的研究與開發(fā)具有重要意義[16]。

外用金黃散處方中君藥為苦寒解毒藥，如大黃、黃柏；臣藥為燥濕化痰行氣的天南星、陳皮、厚樸和破血行氣藥姜黃；使藥為辛溫祛風(fēng)燥濕、消腫止痛藥，如白芷[17]。其藥理活性涉及到的化學(xué)成分有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、橙皮苷、甘草酸、歐前胡素等，這些化學(xué)成分可通過多種途徑發(fā)揮協(xié)同作用，因此，采用多指標(biāo)進(jìn)行藥品質(zhì)量控制意義重大[18]。

本研究通過建立QAMS法同時(shí)測定外用金黃散提取物中甘草苷、橙皮苷、甘草酸、大黃酸、歐前胡素、大黃素甲醚的含量，該方法與外標(biāo)法所測得的含量無顯著差異，說明建立的相對校正因子可靠可行，可達(dá)到1個(gè)對照品同時(shí)測定7個(gè)成分含量的目的，同時(shí)可降低多組分質(zhì)量控制的檢測成本，可為外用金黃散提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。