干擾長鏈非編碼RNA MALAT1對結(jié)腸癌SW480細胞生長、侵襲和裸鼠成瘤的影響

裴正浩，王耿澤，夏西超，張虎，王鈞，郝陽

（1.南陽市中心醫(yī)院胃腸外科，河南 南陽 473000；2.平頂山學院醫(yī)學院，河南 平頂山 467000）

結(jié)腸癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，盡管其臨床診療已經(jīng)取得了長足進展，但對于復發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌仍缺乏有效的治療手段，患者一般預后較差[1-2]。最近研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）是長度約8 000核苷酸的lncRNA，MALAT1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中表達上調(diào)。在人類結(jié)腸癌中MALAT1表達升高，其高表達與結(jié)腸癌患者不良預后密切相關(guān)[5]，但其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相關(guān)機制尚不完全清楚。因此本研究通過使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）敲低結(jié)腸癌SW480細胞的MALAT1基因表達，并觀察其對細胞增殖、侵襲等生物學特性以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響，旨在了解MALAT1基因在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物結(jié)腸癌SW480細胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雄/雌BALB/c-nu品系裸鼠10只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），SPF級，體質(zhì)量15～20 g，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0009；本研究根據(jù)實驗動物管理與保護的有關(guān)規(guī)定飼養(yǎng)動物并進行實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器MALAT1-shRNA、shRNANC真核質(zhì)粒載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；miR-145 mimic、miR-145 inhibitor（美國Invitrogen公司）；Western blot檢測一抗（Abcam公司）；HRP標記的IgG二抗（美國Jackson公司）；PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（寶生物工程有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（賽默飛世爾科技公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；7500RTPCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染取SW480細胞接種于含10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合率達85%以上傳代培養(yǎng)。取生長良好的細胞用于轉(zhuǎn)染和后續(xù)試驗。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-369-3 pmimic、mimic-NC、pcDNA、pc-RAB10重組質(zhì)粒、mimic+pc-RAB10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549、H1299細胞，分別記為mimic組、mimic-NC組、pcDNA組、pc-RAB10組及pc-RAB10+mimic組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析使用Trizol試劑從收集的組織和細胞株提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參，按照試劑盒操作方法檢測目標mRNA表達水平，采用2-ΔΔCt法計算目標mRNA相對表達量。

1.2.3 靶基因預測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灢捎肨argetScan軟件預測MALAT1與miR-145的靶向關(guān)系；根據(jù)靶基因預測軟件預測的可能結(jié)合位點體外合成該位點的DNA片段（MALAT1 wt）以及包含該位點突變體的DNA片段（MALAT1 mut），退火后克隆到雙熒光素酶啟動子載體Pgl3。將該質(zhì)粒和miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染SW480細胞，培養(yǎng)48 h后，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性變化。

1.2.4 Brdu法檢測細胞增殖于24孔板中置入蓋玻片，SW480細胞消化后以2×104個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L Brdu繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出細胞爬片以4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，然后以0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3次，3%BSA室溫封閉1 h后，PBS洗3次；滴加Brdu一抗4℃過夜后，采用預溫的PBS輕輕清洗細胞，然后加入3%BSA稀釋的二抗，室溫避光孵育1 h后PBS洗3次，加入1 μg/mL DAPI室溫避光染色20 min；中性樹膠封片，熒光顯微鏡下取5個視野，統(tǒng)計Brdu陽性細胞數(shù)。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲Matrigel基質(zhì)膠以無血清培養(yǎng)基稀釋（體積比1∶6）后，取100 μL至Transwell小室上室，37℃孵育至基質(zhì)膠為固態(tài)。待轉(zhuǎn)染后各組細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)消化細胞，無血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為1×105個/mL。取200 μL細胞懸液加入上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細胞，用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，每孔隨機選取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計，每組設置3個復孔。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達收集的各組細胞以PBS沖洗后使用細胞裂解液冰上充分裂解提取總蛋白。BCA法定量蛋白樣品后，加入適量上樣緩沖液，取40 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以GAPDH為內(nèi)參，分別加入JAK2，STAT3、p-STAT3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加二抗室溫下孵育2 h，ECL法顯色，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 免疫熒光檢測Vimentin蛋白表達于24孔板中置入蓋玻片，SW480細胞消化后以2×104個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24～48 h后取出細胞爬片，參照“1.2.4”方法進行固定、染色，滴加抗體為Vimentin抗體。中性樹膠封片后，熒光顯微鏡下取5個視野，統(tǒng)計Vimentin陽性細胞數(shù)。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤實驗10只裸鼠分為Control組和shRNA-MALAT1組各5只，取對數(shù)生長期的SW480細胞，調(diào)整細胞密度1×106個/mL，對照組裸鼠于皮下注射未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW480細胞200 μL，shRNA-MALAT1組于皮下注射轉(zhuǎn)染shRNA-MALAT1的SW480細胞200 μL；每間隔5 d標尺測量腫瘤體積，30 d后處死裸鼠，剝離瘤體，稱量移植瘤體積并拍照。取10%（φ）甲醛溶液固定移植瘤組織，洗滌后進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和4 mm連續(xù)切片。

1.2.9 免疫組織化學法檢測移植瘤組織中蛋白表達移植瘤組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后采用3%H2O2孵育5 min后，加入5%山羊血清孵育20 min，甩去多余液體，加入適當稀釋的Ki67、VEGF抗體4℃下孵育過夜，PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG二抗，37℃下孵育20 min，PBS沖洗后滴加SABC，37℃下孵育30 min。采用DAB顯色，控制顯色時間，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察染色結(jié)果。400倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，利用Motic Images Advanced 3.2圖像采集系統(tǒng)分析每個視野陽性細胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 7作圖，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1與miR-145靶向關(guān)系

TargetScan分析miR-145與MALAT1的結(jié) 合位點見圖1（A）；轉(zhuǎn)染后，與Control組比較，shRNAMALAT1組MALAT1表達水平顯著下降（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-145 mimic和野生型MALAT1報告基因載體后，SW480細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 MALAT1與miR-145靶向關(guān)系Figure 1 Targeted relationship between MALAT1 and miR-145

2.2 敲低MALAT1對SW480細胞增殖、侵襲的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組Brdu陽性細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），miR-145 inhibitor組Brdu陽性細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與miR-145 inhibitor組比較，shRNA-MALAT1+miR-145 inhibitor組Brdu陽 性 細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 敲低MALAT1通過上調(diào)miR-145抑制SW480細胞增殖、侵襲Figure 2 Knockdown of MALAT1 inhibits the proliferation and invasion of SW480 cells by upregulating miR-145

2.3 敲低MALAT1對SW480細胞侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；miR-145 inhibitor組N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。與miR-145 inhibitor組比較，shRNA-MALAT1+miR-145 inhibitor組E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 敲低MALAT1對SW480細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響Figure 3 Effect of MALAT1 knockdown on the expression of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in SW480 cells

圖4 敲低MALAT1對Vimentin蛋白表達的影響Figure 4 Effect of MALAT1 knockdown on the expression of Vimentin in SW480 cells

2.4 敲低MALAT1對SW480細胞JAK2/STAT3信號通路的影響

與Control組 比 較，shRNA-MALAT1組JAK2、p-STAT3/STAT3比值顯著降低（P＜0.05），提示敲低MALAT1表達抑制JAK2/STAT3信號通路激活。見圖5。

圖5 敲低MALAT1對SW480細胞JAK2/STAT3信號通路的影響Figure 5 Effect of MALAT1 knockdown on JAK2/STAT3 pathway in SW480 cells

2.5 敲低MALAT1對SW480細胞裸鼠成瘤能力的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組成瘤體積顯著降低（P＜0.05）；qRT-PCR檢測顯示，與Control組比較，shRNA-MALAT1組移植瘤組織中MALAT1表達顯著降低，miR-145表達顯著增加（P＜0.05）；免疫組化染色顯示，shRNA-MALAT1組移植瘤組織中Ki67、VEGF蛋白表達較Control組顯著降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 敲低MALAT1對SW480細胞裸鼠成瘤能力的影響Figure 6 Effect of MALAT1 knockdown on tumorigenicity of SW480 cells in nude mice

3 討論

lncRNA作為一類長度大于200 nt的非編碼RNA，其異常表達在多種癌癥的起始和進展中起重要作用，在諸多研究中顯示出其作為腫瘤調(diào)控因子和治療靶標的潛能。在急性單核細胞白血病中，MALAT1上調(diào)導致預后不良，影響細胞增殖和凋亡[6]；MALAT1上調(diào)導致非小細胞肺癌預后較差，可誘發(fā)腫瘤生長和遷移[7]；MALAT1在人類結(jié)腸癌中表達被上調(diào)，其高表達與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切密切相關(guān)[5]；此外，抑制MALAT1表達能抑制結(jié)腸癌進展[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MALAT1顯著抑制了SW480細胞的生長和侵襲，與本實驗結(jié)果一致的是，之前的研究[9]亦表明，MALAT1的高表達通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

miRNA是一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，由18～25個核苷酸組成，能通過與目標RNA互補配對干擾其合成從而達到調(diào)控靶基因的目的[10-11]。本研究結(jié)果顯示，miR-145在結(jié)腸癌細胞中則顯示出與MALAT1相反的作用，與本研究結(jié)果一致的是，相關(guān)報道[12]顯示，在結(jié)直腸癌臨床樣本中發(fā)現(xiàn)了miR-145，并通過體外實驗證實miR-145通過靶向ETS相關(guān)基因削弱癌細胞的遷移和侵襲能力。通過靶向基因預測軟件和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾緈iR-145是MALAT1的結(jié)合靶點，結(jié)合以往研究推測MALAT1可能作為一種競爭性內(nèi)源RNA結(jié)合miR-145并抑制其作用，而在結(jié)腸癌進展中發(fā)揮重要作用。

向正常組織浸潤和侵襲是惡性腫瘤細胞的基本生物學特征，該過程包括腫瘤細胞的脫落、黏附、降解、移動等。隨著腫瘤微環(huán)境的惡化，腫瘤細胞首先脫離原發(fā)部位，侵入到ECM、基底膜和細胞間質(zhì)中[13-15]。筆者通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，敲低MALAT1的SW480細胞表現(xiàn)出的侵襲性明顯降低。在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是重要的始動因素，在EMT過程中，負責上皮細胞黏附連接的蛋白如E-cadherin能被提供更大連接靈活性的蛋白如N-cadherin等取代，從而導致細胞分離和運動性增強，使得腫瘤細胞易于侵入血管，并穿過血管壁外滲形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶。在功能上，本研究發(fā)現(xiàn)體外敲低MALAT1能抑制SW480細胞的侵襲和EMT過程。miRNAs通過靶向其下游分子調(diào)控癌變，因此預測和確認miR-145的下游作用靶點對于揭示miR-145抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。JAK2是蛋白酪氨酸激酶JAK家族成員，在癌變過程中發(fā)揮著多種功能。已有研究[16]表明，JAK2在結(jié)直腸癌等多種腫瘤中通過調(diào)節(jié)STAT3的磷酸化發(fā)揮致癌基因的作用；JAK2/STAT3通路在結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移和EMT中起關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示，MALAT1在SW480細胞中可能通過調(diào)控miR-145抑制JAK2/STAT3通路的激活從而調(diào)控其下游靶點的表達，包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，而此三者是人結(jié)腸癌細胞中EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。然而在進行靶基因預測時，本研究并未發(fā)現(xiàn)miR-145與JAK2存在潛在結(jié)合靶點，miR-145是否通過與JAK2/STAT3通路的上游因子靶向結(jié)合而調(diào)節(jié)該信號通路從而影響結(jié)腸癌細胞的EMT過程和侵襲轉(zhuǎn)移有待于進一步研究。

綜上所述，在結(jié)腸癌細胞中，MALAT1作為一種競爭性內(nèi)源RNA負向調(diào)節(jié)miR-145功能，敲低MALAT1可通過負調(diào)控miR-145功能從而抑制結(jié)直腸癌SW480細胞的增殖、侵襲及體內(nèi)成瘤能力。