雞蛋黃脂質組的高通量鑒定與解析

何虹霄，周春燕，王 藝，翟世英，耿 放，王金秋

(成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106)

0 引 言

雞蛋的營養價值高，價格相對較低，是“性價比”(營養價格比)最高的食品之一[1].與雞蛋清相比，雞蛋黃中的營養物質種類和含量更高.雞蛋黃中干物質含量約為50%，其干物質主要包括65%～70%的脂質和約30%的蛋白質[2].雞蛋黃脂類因富含磷脂等功能性脂質被認為具有較高的營養價值.按類別，雞蛋黃脂質中約含65%甘油酯，28%～30%磷脂，4%～5%膽固醇，以及少量的游離脂肪酸等其他脂質.在脂肪酸組成方面，雞蛋黃脂質水解后的脂肪酸以棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)為主[3].在雞蛋黃的脂質類別和脂肪酸組成方面，已有諸多研究報道.但對雞蛋黃脂質的分子種類，即甘油(或其他配體)和脂肪酸的不同組合，當前的研究和報道相對較少.

由于脂質的分子種類呈現多樣性，這為脂質分子的鑒定帶來了挑戰.近年來，隨著質譜技術的不斷發展，可實現對生物樣品中脂質分子種類的高通量鑒定，由此，脂質組概念被提出并得到快速發展.當前，脂質組已廣泛應用于食品的研究和檢測中.例如，朱玲嬌[4]對禽蛋磷脂的組成及其脂肪酸的分布進行了分析研究；李靜[5]不僅對不同種類的禽蛋及蛋制品中的膽固醇含量進行了分析測定，還對受精蛋蛋黃中膽固醇含量在孵化期間的變化規律進行了研究.基于液質聯用(LC-MS/MS)的脂質組分析流程具有高通量與高準確度的特點，已被應用于畜產食品中脂質的分析.例如，Gu等[6]從牦牛、犏牛和黃牛的里脊肉中鑒定到296種脂質分子，定量分析顯示磷脂和酰基肉堿是3個品種牛肉中差異較大的脂質分子類別.但目前尚無關于雞蛋黃整體的脂質分子種類鑒定和分析報道.基于此，本研究運用脂質組分析技術對雞蛋黃樣品中的脂質分子種類進行鑒定和相對定量分析，從而實現對雞蛋黃脂質的詳細了解，為進一步優化雞蛋貯藏保鮮方案，加工工藝條件，以及開發高附加值蛋制品提供重要參考.

1 材料與方法

1.1 儀 器

Shimadzu CBM-30A型超高效液相色譜儀(上海島津實驗器材有限公司)，Qtrap-4500型質譜儀器(上海SCIEX分析儀器貿易有限公司)，Agilent 7890B型氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，HH-S6型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)，JA2003型分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司).

1.2 材 料

新鮮雞蛋，由四川圣迪樂村生態食品股份有限公司家禽養殖場提供；甲醇、甲酸銨、甲基叔丁基醚、乙腈、氯仿、醋酸、正己烷，均為色譜純，購自美國默克公司；甲苯、石油醚、濃硫酸，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；混合脂肪酸甲酯標準品，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；溶血磷脂酰膽堿(12∶0，LPC)、神經酰胺(d18∶1/4∶0，Cer)、磷脂酰膽堿(13∶0/13∶0，PC)、甘油二酯(12∶0/12∶0，DG)、甘油三酯(17∶0/17∶0/17∶0，TG)，購自阿凡提極地脂質公司.

1.3 方 法

1.3.1 雞蛋黃樣品的制備

用蛋黃分離器分出雞蛋黃，將收集的雞蛋黃在濾紙上滾動以去除吸附在蛋黃膜上的蛋清液和系帶，直到能肉眼看到蛋黃膜表面比較干燥為止.用牙簽刺破蛋黃膜，然后用燒杯收集流出的蛋黃液.共收集15 枚雞蛋的蛋黃液，磁力攪拌充分混勻.用移液器吸取蛋黃液并分裝至50 mL離心管中，立即用液氮迅速冷凍，然后放入冰箱(-80 ℃)進行超低溫保存，用于后續檢測分析.

1.3.2 脂質組分析前處理

樣品從-80 ℃冰箱中取出，在液氮下手動研磨至粉末狀，稱取50 mg置2 mL離心管中，并向離心管中加入1 mL脂質提取液(甲基叔丁基醚和甲醇混合物，3∶1，V/V)，并放入鋼珠，用球磨機將樣品勻漿.取出鋼珠，加入500 μL水，渦旋混勻1 min，然后在12 000 ×g、4℃下離心10 min.吸取上層清液500 μL于1.5 mL離心管中，真空濃縮器揮干溶劑至恒重，用100 μL含有0.04%乙酸的乙腈溶液復溶.

1.3.3 液相分離

色譜柱為Thermo C30，2.1 mm×100 mm(內徑×柱長)，填料粒徑2.6 μm.流動相A為乙腈∶水混合溶液，體積比為60∶40(含0.04%乙酸與5 mmol/L甲酸銨)；流動相B為乙腈∶異丙醇混合溶液，體積比為10∶90(含0.04%乙酸與5 mmol/L甲酸銨).進樣量為2 μL.梯度洗脫程序為：0 min，A∶B=80∶20；3 min，A∶B=50∶50；5 min，A∶B=35∶65；9 min，A∶B=25∶75；15.5 min，A∶B=10∶90.流速為0.35 mL/min，柱溫45 ℃.

1.3.4 質譜分析

電噴霧離子源溫度為550 ℃；質譜電壓為5 500 V(正極)或-4 500 V(負極)；簾氣壓力241.3 kPa；碰撞誘導電離參數設置為中；在三重四極桿中，每個離子對根據優化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測.

1.3.5 脂質分子的定性

基于靶向標準品數據庫MWDB，根據檢測物質的保留時間、子母離子對信息(50～1 000 m/z)及二級譜數據進行脂質分子的鑒定.

1.3.6 脂質分子的相對定量

基于代謝物的質譜信號強度進行相對定量分析，通過三重四極桿質譜的多反應監測模式進行分析.脂質組分析重復測定3次.

2 結果與分析

2.1 雞蛋黃中脂質的分子種類

脂肪酸的不同組合可以形成種類豐富的脂質分子.大量研究顯示，食品中脂質的分子種類可多達數百上千種.這些不同結構的脂質分子具有不同的特性，因此，若要對食品中的脂質進行系統地了解，需對其脂質分子種類進行鑒定.

脂質組分析結果顯示，共從雞蛋黃樣品中鑒定出787種脂質分子.其中，甘油酯及脂肪酸類包括212種TG、55種DG、3種單甘油酯(MG)和37種游離脂肪酸(FFA).磷脂類包括139種PC、122種磷脂酰乙醇胺(PE)、34種LPC、23種溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、14種磷脂酰甘油(PG)、14種磷脂酰絲氨酸(PS)、4種磷脂酸(PA)、4種磷脂酰肌醇(PI)、2種溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)、1種溶血磷脂酸(LPA)、1種溶血磷脂酰肌醇(LPI)和1種溶血磷脂酰甘油(LPG)、41種Cer和30種鞘磷脂(SM).其他脂質包括36種酰基肉堿(CAR)、9種膽固醇脂(CE)、2種輔酶Q(COQ)和3種類花生酸(Eicosanoid).

基于鑒定到的脂質分子在質譜中的信號強度，對雞蛋黃中鑒定到的787種脂質分子進行相對含量分析.結果顯示，雞蛋黃脂質中磷脂的相對含量最高，為64.5%，其中PE和LPE含量最為豐富.雞蛋黃中甘油酯相對含量為26.7%，主要為TG和DG.FFA相對含量為8.1%，CAR相對含量為0.31%，其他脂質相對含量較少.

2.2 雞蛋黃中的磷脂

在鑒定到的139種雞蛋黃PC分子中，相對含量最高的3種PC分子為PC(18∶0/22∶5)、PC(16∶1/22∶2)和PC(22∶4/14∶1)，分別占雞蛋黃總PC的18.1%、13.0%和6.1%(見圖1(A)).在34種LPC分子中，LPC(18∶1/0∶0)占雞蛋黃中所有LPC的61.8%(見圖1(B))，表明LPC類別中，脂質分子的相對含量比較集中.此外，在豐度前十的PC分子和豐度前五的LPC分子中，PC(18∶0/22∶5)、PC(22∶4/14∶1)、PC(18∶1/22∶6)、PC(16∶1/22∶6)、LPC(20∶4/0∶0)和LPC(22∶6/0∶0)均含有二十二碳六烯酸(C22∶6，DHA)、二十二碳五烯酸(C22∶5，DPA)和二十碳四烯酸(C20∶4，ARA)等長鏈多不飽和脂肪酸，表明雞蛋黃PC和LPC具有較高的營養價值.

圖1 雞蛋黃中的主要PC和LPC

雞蛋黃中PE和LPE分子相對含量亦具有類似特點.PE分子的相對含量相對分散，前3種PE分子合計占比為30.9%(見圖2(A))；而LPE分子的相對含量相對集中，前3種LPE分子合計占比達到85.8%(見圖2(B)).相對PC和LPC，在豐度靠前的PE和LPE分子中含有DHA和ARA的分子種類較少，僅PE(18∶0/22∶6)、LPE(0∶0/22∶6)和LPE(0∶0/20∶4)3種分子.這在一定程度上表明，雞蛋黃中PE的營養價值可能弱于PC.

圖2 雞蛋黃中的主要PE和LPE

2.3 雞蛋黃中的SM和Cer

SM是鞘氨醇的氨基以酰胺鍵與1分子脂肪酸相連形成的，含有鞘氨醇或二氫鞘氨醇，但不含甘油的磷脂.蛋黃中鑒定到30種SM和41種Cer.其中，SM(d18∶1/22∶0)、1-磷酸神經氨酸(d18∶1/16∶0,CerP)和Cer(d18∶1/24∶1)3種分子豐度最高，占雞蛋黃總SM和Cer的15.1%、10.8%和7.8%(見圖3).豐度前10的SM和Cer分子中，不飽和雙鍵的數量為1～3個，與PC(不飽和雙鍵的數量為1～7個)和PE(不飽和雙鍵的數量為0～6個)相比明顯較少，表明雞蛋黃中SM和Cer分子的飽和度相對較高.

圖3 雞蛋黃中的主要SM和Cer

2.4 雞蛋黃中的甘油酯

脂肪酸甘油酯根據甘油骨架上結合的脂肪酸數目不同進行分類，分為TG、DG和MG.在雞蛋黃脂質中檢測出212種TG、55種DG和3種MG.雞蛋黃中TG的種類豐富，脂肪酸的雙鍵數、雙鍵位置，以及不同脂肪酸的組合等形成了TG的多樣性.而雞蛋黃脂質中的DG種類相對較少.

在所鑒定到的甘油酯中，DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)和TG(16∶0/16∶1/20∶1)的相對含量最高，分別占蛋黃總甘油酯的15.6%、13.1%和8.2%(見圖4).這3種甘油酯均含有2個單不飽和脂肪酸(MUFA)，顯示出雞蛋黃甘油酯較高的不飽和度.在相對含量前10的甘油酯中，TG(18∶1/18∶1/18∶2)的不飽和度最高，其占雞蛋黃總甘油酯的3.5%.

圖4 雞蛋黃中的主要甘油酯

2.5 雞蛋黃中的FFA

在雞蛋黃脂質中檢測出37種FFA.其中，油酸(C18∶1)的占比最高，達到雞蛋黃總FFA的38.0%(見圖5)，在雞蛋黃FFA中，鑒定到6種鏈長較短的(C15及以下)脂肪酸，這些脂肪酸在先前基于GC的雞蛋黃總脂肪酸分析中未被鑒定到.這可能是由于檢測方法不同，脂質組分析所采用的LC-MS/MS靈敏度顯著高于雞蛋黃脂肪酸分析所采用的GC.

圖5 雞蛋黃中的主要FFA

雞蛋黃FFA中，飽和脂肪酸(SFA)共12種，占雞蛋黃FFA的19.8%；MUFA共9種，占40.4%；多不飽和脂肪酸(PUFA)共16種，占39.8%.雞蛋黃FFA中PUFA占比顯著高于雞蛋黃總脂肪酸.詳細地，FFA中ARA(C20∶4)、DHA(C22∶6)和DPA(C22∶5)的相對占比，均顯著高于已有報道的雞蛋黃總脂肪酸.這些結果顯示出雞蛋黃FFA的整體不飽和度更高.

2.6 雞蛋黃中的CAR

本次實驗在雞蛋黃脂質中檢測到36種CAR.其中，油酰基肉堿(Oleyl-carnitine)和戊二酰基肉堿(Glutaconyl-carnitine)占比最高，兩者合計約占雞蛋黃總CAR的50%(見圖6).按照鏈長劃分，雞蛋黃CAR中短鏈CAR有8種(C2～C5)、中鏈CAR有13種(C6～C12)和長鏈CAR有15種(C13以上).

圖6 雞蛋黃中的主要CAR

2.7 雞蛋黃中的DHA和二十碳五烯酸(EPA)

在雞蛋黃TG和磷脂中鑒定出29種含有DHA的脂質分子，13種含有EPA的脂質分子.DHA主要以磷脂的形式存在于雞蛋黃中，其中48.7%為PE-DHA，39.0%為PC-DHA和11.2%為LPE-DHA，而TG-DHA和DG-DHA僅占0.74%.EPA亦具有相似的規律，79.2%為PC-EPA，20.2%為PE-EPA，0.45%為LPE-EPA，僅0.15%為TG-EPA.DHA和EPA的營養功效已經被深入研究和廣泛認可.雞蛋黃中DHA和EPA主要存在于磷脂中，表明雞蛋黃磷脂具有優異的營養價值.

3 討 論

3.1 脂質組分析的定量準確性

值得注意的是，不同類型脂質在離子化效率與碎裂難易等方面具有顯著的不同，這使得不同脂質類別的質譜信號響應強度具有較大差異.例如，檢測到的雞蛋黃PE含量高于PC，可能的原因是PE和PC分子中sn-3位上的極性頭部基團存在差異，導致PE在質譜檢測中離子化效率或信號響應高于PC.因此，基于質譜信號強度進行跨類別的相對含量計算和對比將產生較大誤差.基于此，需針對每個脂質類別分別開展定量分析.

3.2 雞蛋黃脂質分子與雞胚發育

在雞胚發育過程中，TG和DG的吸收需要跨越絨毛尿囊膜，在跨膜過程中，被水解為甘油和FFA.其中，部分FFA參與雞胚發育的能量供給；另一部分脂肪酸重新與甘油組裝形成甘油酯，進而參與細胞膜的構建.在貯藏過程中，雞蛋黃中少量的TG和DG在雞蛋黃內源脂肪酶的作用下被水解，產生FFA，這一過程被認為是雞蛋黃自身抑制脂質氧化的一種潛在機制[7].

雞蛋黃中的FFA在雞胚發育能量供給方面具有天然優勢，因為他們可以更快地被轉運至雞胚中并直接通過β-氧化提供能量.因此，雞蛋黃中保持一定含量的FFA，可能是為雞胚發育的啟動做準備.此外，相對于TG和磷脂，FFA可以直接與自由基等反應，從而為雞胚和雞蛋黃脂質提供抗氧化的屏障.這可能是FFA中PUFA占比相對更高的潛在原因.

CAR是肉堿與脂肪酸結合形成的一類代謝物，是脂肪酸參與β-氧化的中間物質.在脂酰輔酶A合成酶的催化下，脂肪酸首先被活化為脂酰輔酶A，長鏈脂酰輔酶A需要進一步與肉堿形成CAR，以跨越線粒體內膜進入線粒體基質，從而參與β氧化.由此，推測雞蛋黃中微量的CAR，對保證雞胚發育啟動時的快速能量供給具有重要作用.

3.3 雞蛋黃磷脂分子與蛋黃營養特性

膳食中高比例的磷脂有利于食物脂質在小腸中形成平均粒徑更小的球形膠束[8]，從而影響人體對脂質的消化和吸收.此外，雞蛋黃中含有豐富的SM和Cer.作為重要的結構脂質，SM和Cer主要位于細胞膜、脂蛋白和其他富含脂質的組織結構上，對維持細胞膜的完整性，以及脂筏的形成至關重要.同時，SM和Cer廣泛參與細胞分化、增殖和凋亡等重要生理過程，并在細胞代謝和信號轉導、細胞生長分化、細胞凋亡調節、機體衰老和腫瘤免疫等方面發揮著重要作用.此外，SM和Cer還是合成一系列重要生理鞘脂的通用前體.因此，膳食SM和Cer具有諸多健康功效作用，不僅參與細胞膜的形成并維護其流動性，還能防止脂質代謝異常、發揮抗氧化與抗炎作用[9].已有研究表明，膳食SM及其代謝產物可以劑量依賴性地抑制膽固醇、TG和脂肪酸的吸收，并可顯著改善動物血漿與肝臟的膽固醇和TG代謝[10].此外，膳食SM有利于腸道微生物群和胃腸道免疫的穩態平衡，動物實驗和臨床研究已證實牛奶SM具有較好的降血脂作用[11].

4 結 論

本研究運用LC-MS/MS對雞蛋黃中的脂質分子進行了鑒定和定量分析，共鑒定到787種脂質分子.相對定量分析顯示，PC(18∶0/22∶5)、LPC(18∶1/0∶0)、PE(P-18∶0/18∶0)、LPE(0∶0/18∶0)、SM(d18∶1/22∶0)、DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)、油酸(C18∶1)和油酰基肉堿(Oleyl-carnitine)分別是各自脂質類別中的代表性脂質分子.此外，統計顯示，DHA和EPA等功能活性脂肪酸主要存在于雞蛋黃磷脂中.本研究提供了雞蛋黃脂質分子種類的詳細信息，為進一步探究雞蛋黃脂質營養功能和加工特性等提供了重要信息和研究方向.